［摘要］目的：探讨人补体 C_5b～9复合物对大鼠肾小球系膜细胞(MC)合成一氧化氮(NO)的影响。方法：首先提取人补体C_5b～9复合物，同时培养出大鼠肾小球MC。然后用C_5b～9复合物刺激MC，观察刺激后6 h、24 h、和48 h培养上清液中NO代谢产物-硝酸根(NO^-₃)和亚硝酸根(NO^₂)量的变化，并测定刺激后24 h、48 h时MC内环鸟苷酸(cGMP)的水平。结果：用人C_5b～9复合物刺激大鼠MC后可致培养上清中NO^₃/NO^₂含量增加，细胞内cGMP水平上升。NO合成增多能够被NO合酶(NOS)抑制剂—─-N^G-硝基-L-精氨酸甲基酯(L-NAME)所抑制。结论：人C_5b～9复合物能够增加大鼠肾MC 的NO合成。

［中图分类号］ R692.3［文献标识码］ A

［文章编号］ 1000-4718(2000)03-0262-04

The effect of human complement C_5b～9 complex on nitric oxide synthesis in glomerular mesangial cells of rats

WANG Ying-wei, HE Qiu-zao, QIN Hui-lian, TANG Ren-xian, GAO Feng-guang, ZHANG Guang-yi

(Dept of Immunology, Xuzhou Medical College, Xuzhou 221002, China)

［Abstract］AIM：To study the effect of human complement C_5b～9 complex on nitric oxide(NO) synthesis of glomerular mesangial cells (MC).METHODS: First, the human complement C_5b～9 complexes were isolated and glomerular MC of rats were cultured. Second, the MC were stimulated with C_5b～9 complex and changes of metabolism products of NO（NO^₃ and NO^₂） in MC culture supernatant at 6,24 and 48 hours after C_5b～9 stimulating were detected. Moreover, cGMP levels in cultured MC were also measured. RESULTS： NO^₃／NO^₂ contents from culture supernatant and cGMP levels in MC were increased parallelly after C_5b～9 complex stimulation. Further, NO synthesis was inhibited by L-N^G-nitro-arginine-methylester(L-NAME). CONCLUSION： NO synthesis of rat glomerular MC was incerased by human complement C_5b～9 stimulation.

［MeSH］Complement membrane attack complex; Glomerular mesangium; Cells; Nitric oxide; Rats

近年来对一氧化氮(nitric oxide， NO)参与机体组织功能的变化日益为人们所关注^［1］。肾小球炎症时，NO合成的增加不仅可以改变肾小球的滤过率，而且还可引发肾细胞的病理损伤。已有资料表明，肾炎时肾内NO合成的增多与某些刺激因子如细菌脂多糖，肿瘤坏死因子α（tumour necrosis factor α，TNF－α）等作用密切相关^［2］。另有实验证实，补体C_5b～9复合物可作为肾细胞有效的刺激剂。亚溶量的C_5b～9复合物能够插入细胞膜磷脂双层，参与细胞信号传导并激活细胞多种代谢途径，致使炎性介质释放，蛋白酶活化及代谢产物的堆积等^［3，4］。本文利用提取的人补体C_5b～9复合物作为刺激因子，观察它对体外培养的大鼠肾小球系膜细胞(mesangial cell,MC)合成NO的影响。

材料和方法

一、主要材料

健康人血清由徐州市中心血站健康B型献血员提供。小牛血清购自南京卫岗血清厂。Ⅳ型胶原酶、牛胰岛素、L-精氨酸、L-NAME及3-异丁－甲基黄嘌呤(3-isobuthyl-1-methylxanthine，IBMX)均属Sigma公司产品。RPMI 1640干粉购自GIBCO公司。单克隆抗结蛋白、肌动蛋白、细胞角蛋白及第Ⅷ因子抗体为DAKO公司产品。多克隆抗人C₃、C₅和C₉抗体及ABC法染色试剂购自上海生物制品研究所，多克隆抗人C_5b～9复合物及C_5b～9标准抗原由中国医学科学院基础所生化室提供。NO^-₃/NO^-₂测定试剂盒由南京建成生物工程研究所供应。［³H］-cGMP放免试剂盒来源于中国原子能研究院。SD大鼠及长耳白兔由徐州医学院实验动物中心提供。

二、实验方法

1.人补体C_5b～9复合物的提取取新鲜正常人血清300mL加入等体积10％的兔红细胞悬液，37℃水浴至兔红细胞全部溶血，离心洗涤沉淀的兔红细胞膜，再用10%脱氧胆酸钠溶解。样品经不同梯度蔗糖超速离心180?000×g 3h后分段分管收集。各管液体先行电镜负染法检查提取物，再分别用抗人C₃、C₅、C₉及抗人C_5b～9复合物抗体进行斑点ELISA(Dot-ELISA）法鉴定。鉴定后的人补体C_5b～9复合物经透析和超滤浓缩后按Lowry法测定蛋白量，-20℃保存。具体步骤参见文献^［5，6］。

2.大鼠肾MC的培养与鉴定取SD大鼠5只，雌性，体重150～200 g，乙醚麻醉后经胸主动脉插管用冷Hanks液灌洗双肾，剪取的肾皮质经50目、100目及200目不锈钢筛网分离收获肾小球，然后加入Ⅳ型胶原酶消化20 min。消化后的肾小球置于完全营养液（RPMI 1640＋20％小牛血清＋0.66 U／mL胰岛素)37℃ 5% CO₂孵箱中培养。培养各期的MC用倒置显微镜、光镜、电镜作常规检查。原代培养2周及传代培养1周的MC以单克隆抗结蛋白、肌动蛋白、角蛋白及第VIII因子抗体为一抗，行常规ABC法染色鉴定。

3. C_5b～9复合物刺激剂量的确定及MC的分组处理原代培养3周的MC配成1×10^５／mL悬液后转种24孔培养板。传代第3 d将培养液换成不含酚红液的RPMI 1640营养液(添加10％小牛血清及1 mmol／L精氨酸)培养24 h。然后取1块24孔培养板按不同浓度加入C_5b～9复合物(1μg、10μg、20μg、40μg及80μg／mL)静置培养24 h，分别收集各孔的培养上清液用NO测定试剂盒测定NO^₃/NO^₂含量，根据NO^₃／NO^_２量确定C_5b～9复合物刺激的最佳剂量(注：此次以40μg／mL C_5b～9复合物刺激效果最好)。其余培养板中的MC分别作如下处理：(1)C_5b～9组：每孔加含C_5b～9复合物40μg/mL的营养液1mL。(2)L-NAME组：每孔加入含2mmol／L的 L-NAME营养液1 mL。(3)C_5b～9＋L-NAME组：每孔中加入含C_5b～9复合物40μg／mL及含2 mmol／L的L-NAME营养液1 mL。(4)对照组：每孔仅加营养液1 mL。各组均设6个复孔。

4. 检测指标（1）NO^₃／NO^₂含量：上述分组处理的各孔培养的MC继续培养6h、24h、48h后分别收集其培养上清液用硝酸还原酶法测定上清液中NO^₃／NO^₂的浓度。结果以μmol/L表示。（2）cGMP水平分组处理同前所述，但各组所用的试剂中再加入终浓度为0.5 mmol／L IBMX，培养24 h和48 h后弃去营养液，细胞用生理盐水洗涤2次。留于孔内的细胞再用5％冷三氯醋酸处理1h。样品吸出后三氯醋酸经水饱和乙醚抽提4次除去。各组样品用［³H］-cGMP放免分析试剂盒测定其cGMP含量。孔内的MC蛋白经1％SDS溶解过夜，Lowry法定蛋白含量。最后以所测各孔cGMP值除以各孔MC蛋白量进行计算，结果以pmol/mg蛋白表示。

三、统计分析

所得数据用±s表示，均数差异显著性用计算机PEMS软件检验判断。

结果

一、人C_5b～9复合物的鉴定

抽提的人C_5b～9复合物样品经不同梯度蔗糖超速离心后可见离心管中上部有一乳白色的致密环，电镜负染显示该致密物中主要是一些呈空心环状、γ形或π样的结构，这与国外文献报道的结果基本一致。另用Dot-ELISA法检测表明，提取的人C_5b～9复合物经抗人C₅、C₉和C_5b～9抗体染色均呈阳性，而用抗人C_３染色呈阴性反应。

二、肾小球MC的培养

倒置显微镜观察发现，经三道筛网分离的肾小球纯度达90%以上。原代培养4～6天肾小球多已贴壁。最初从肾小球中长出的细胞含有圆形或卵圆形的上皮细胞，2周后上皮细胞渐渐死亡，残留的MC多呈星形，梭形或不规则状。HE染色镜检MC形态有不规则突起。培养的MC电镜下可见富含微丝结构。原代培养2周后或传代培养的MC经免疫组化染色显示胞浆内结蛋白，肌动蛋白呈阳性，而细胞角蛋白(上皮细胞含有)，第Ⅷ因子(内皮细胞含有)呈阴性。由此排除了上皮细胞及内皮细胞混杂生长的可能性。