［摘要］目的：研究接触激活系统对尿激酶型纤溶酶原激活物（U-PA)引起单核细胞粘附的影响及它们之间的相互关系。方法：［³H］-TdR标记的U937细胞培养于24孔板，在高分子激肽原(HK/HKa)，激肽释放酶(kallikrein,KK),因子Ⅻ(factor Ⅻ)和纤溶酶原(plasminogen)的作用下，观察U937细胞的粘附情况。结果：Hka、KK抑制U-PA引起的单核细胞粘附，因子XⅡ和Plasminogen促进单核细胞粘附。结论：接触激活系统是单核细胞粘附的重要调节因素。

［中图分类号］Q461［文献标识码］ A

［文章编号］1000-4718(2000)03-0233-04

Effect of contact system in monocyte adhesion induced by urokinase-type plasminogen activator

LIU Jian-xia, ZUO Jian-ling, QIN Lei, QIAN Hai-xin

(The First Affiliated Hospital of Suzhou Medical College, Suzhou 215006, China)

LIU Jian-ning

(Vascular ReserchLaboratory, Deaconess Hospital, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts 02215, USA)

［Abstract］AIM:To study the effect of contact system in monocyte adhesion induced by urokinase-type plasminogen activator (U-PA).METHODS:U937 cells were labeled with ［^３H］ thymidine in the culture medium, test reagents were added into the cell suspension in 24-well plates. The counts*min^-1 were counted in a liquid scintillation counter.RESULTS:U-PA-induced monocyte adhesion was inhibited by high-molecular-weight kininogen and kallikrein, and promoted by factor Ⅻ and plasminogen.CONCLUSION:these contact system proteins may be important modulators of U-PA-induced monocyte adhesion, a process which is involved in many pathophysiological events.

［MeSH］ Urokinase; Monocytes; Cell adhesion

单核细胞粘附参与许多病理生理过程如创口愈合、感染、肿瘤浸润和转移等。尿激酶型纤溶酶原激活物（urokinase-type plasminogen activator,U-PA）在单核细胞粘附中起着重要作用,它和U-PA受体结合后，通过cAMP介导的信号传递，引起细胞粘附，从而引发一系列病理生理反应。由于U-PA和内源性接触激活系统中的3种因子激肽释放酶（kallikrein,KK）、高分子量激肽原（high-molecular-weight kininogen,HK/HKa）、十二因子（Ⅻ）及纤溶酶原（plasminogen）与U-PA在功能上密切相关，故本文探讨4种因子对U-PA引起单核细胞粘附的影响。

材料和方法

一、试剂和细胞株

人激肽释放酶、HK(HKa)和Ⅻ(Ⅻa)购于Enzyme Research Laboratories(美国)；U-PA(MW 54 KDa)购于Green cross（日本）；RPMI 1640购于Gibco BRL(美国)；氟磷酸二异丙酯（diisopropyl fluorophosphate,DFP)及胎牛血清（fetal calf serum,FCS）购于Sigma(美国),单核细胞株U937购于Type Culture Collection(美国)。酶的底物S2444和S2302购于Kabi(美国)。

二、U-PA、激肽释放酶、Ⅻa活性灭活

在室温下,U-PA、激肽释放酶、Ⅻa分别在DFP(5 mmol/L)中孵育2 h,充分透析后用S2444检测U-PA的酶活性,S2302检测激肽释放酶和Ⅻa的酶活性，经DFP处理后，它们的酶活性均消失。

三、细胞培养和细胞粘附测定

单核细胞株U937细胞生长于RPMI 1640培养基中,含10% FCS;青霉素(100 U/mL),链霉素(100μg/mL),二性霉素B(0.25μg/mL),在37℃,5% CO₂培养。

细胞粘附测定按WALTG^［1］方法略加改进。U937细胞(1×10⁶/mL)和［³H］-TdR(3.7×10^４Bq/mL)共同培养24 h,离心收集细胞(350×g,4 min,4℃),用无血清RPMI 1640洗涤3次，用含10% FCS的RPMI 1640重悬细胞(1×10⁶/mL)，加入被测试剂后，在24孔板中（300μL/孔）37℃,5% CO₂,培养17h，去上清，用PBS洗涤3次，残留的细胞即为粘附在24孔板上的单核细胞。每孔加入1 mL裂解液(10% glycerol,0.2% sodium dodecyl sulfate,0.2% tritonX-100),每1 mL裂解物加入10 mL液闪液（formula-989 high flash-point cocktail),用液闪仪测定Counts·min^-1,单核细胞粘附的程度用每1000个细胞所对应的Counts·min^-1值表示。

结果

一、U-PA增强U937细胞的粘附作用

按方法所述，U-PA的浓度选择0～5 nmol/L和U937细胞共同培养，发现细胞的粘附作用随U-PA的浓度增高而增强。未发现对照组细胞粘附现象发生（见图1)。用DFP预处理灭活U-PA的酶活性后，U-PA的这种促粘附作用不受影响（见图2B）。

二、HK抑制U-PA引起的细胞粘附

HK和HKa是血清中的抗粘附蛋白，其中HKa的作用更强。U937细胞培养在含10% FCS和10 nmol/L U-PA的培养基中，再加人HK（含10% Hka），HK的浓度由0 nmol/L递增至10 nmol/L。图1显示：HKa可抑制U-PA引起的细胞粘附，HKa对细胞的抗粘附作用随着HKa浓度的增高而加强(见图1）。

三、激肽释放酶对U-PA引起细胞粘附的影响

由于HKa的抗粘附作用明显强于HK，而激肽释放酶催化HK转化为HKa，因此我们也探讨激肽释放酶在细胞粘附中的作用。U937细胞培养在含2 nmol/L的U-PA的培养基中，激肽释放酶的浓度范围0～640nmol/L，结果显示：低浓度的激肽释放酶（200nmol/L）能轻度增强细胞粘附作用。而高浓度激肽释放酶（400nmol/L），则起抑制作用（见图2A）。用DFP预处理使激肽释放酶的酶活性被灭活，激肽释放酶抑制作用即消失（见图2B）。

Fig1U-PA induced monocyte U937 adhesion and the anti-adhesion effect of Hka

［³H］-labeld U937 cells at 1×10⁶/mL were incubated with U-PA (0～10 nmol/L) in the absence or the presence of Hka in 24-well plates. The quantity of the adherent cells were measured and expressed in counts·min^-1 as ±s,n=3

1U-PA诱导的单核细胞U937粘附及Hka的抑制作用

Fig 2Effect of KK on U-PA-induced monocyte U937 adhesion

A.［³H］-labeled U937 cells were cultured in a medium containing 2 nmol/L U-PA and KK(0～640 nmol/L). B.［³H］-labeled U937 cells were incubated with (a) control , (b)1nmol/LU-PA, (c)1nmol/L DFP-U-PA, (d)1nmol/L U-PA and 400nmol/L kK, (e)1nmol/L U-PA and 400 nmol/L DFP-KK. The quantity of the adherent cells were expressed in counts·min^-1 as ±s, n=3

2KK对U-PA诱导的单核细胞U937粘附的影响

四、因子Ⅻ和纤溶酶原在细胞粘附中的作用

因子Ⅻ和纤溶酶原具有促单核细胞粘附作用，当因子Ⅻ和纤溶酶原存在时，U-PA促进单核细胞粘附作用明显加强，预先用DFP处理Ⅻ，将其酶活性灭活，不影响其调节作用（见图3）。

Fig 3Effects of Ⅻ and plasminogen on U-PA induced monocyte U937 cell adhesion

［³H］-labeled U937 cells were incubated with (a),(b),(c) 370 nmol/L Ⅻa/Ⅻ/DFP-Ⅻa, (d)1.5 μmol/L plasminogen, (e)2 nmol/L U-PA, (f),(g),(h) 2 nmol/L U-PA and 370 nmol/L Ⅻa/Ⅻ/DFP-Ⅻa , (i)2 nmol/L U-PA and 1.5 μmol/L plasminogen . The quantity of the adherent cells were expressed in cpm as ±s, n=3

3因子Ⅻ及纤溶酶原对U-PA诱导的单核细胞U937粘附的影响

讨论

已知纤溶和凝血系统之间有密切的关系，U-PA和内源性接触激活系统各因子（Ⅻa,HKa,KK）相互作用，调