［中图分类号］ Q 813.1^＋1［文献标识码］ A

［文章编号］1000-4718(2000)03-0286-03

［MeSH］ Pulmonary artery; Muscle, smooth; Rats

高血压、动脉粥样硬化、肺动脉高压等疾病均以血管平滑肌细胞的异常增生和迁移为特征。为此，近几年来，血管平滑肌细胞的培养已经成为研究工作的基础。目前，仍然多采用贴块片^［1］。因其方便经济、技术难度低，但贴块片确有不足之处，如细胞容易出现“去分化”或“调整”现象。故我们采用单纯胶原酶法（A）和复合胶原酶法（B，包括胶原酶弹性蛋白酶和胰蛋白酶抑制剂）培养肺动脉平滑肌细胞（pulmonary arterial smooth muscle cell, PASMC），并初步观察两种方法培养的PASMC生长状况。

材料和方法

一、主要材料、试剂及配制

Hanks液：先配成贮存液A、B，用时再加等份双蒸水，而后用无菌NaHCO₃调整pH值至7.2左右。A包括：NaCl 40 g, KCl 2 g, CaCl₂ 0.7g, MgSO₄·7H₂O 0.5g; MgCl₂·6H₂O 0.5g加双蒸水溶解定量至250mL。B包括Na₂HPO₄*12H₂O 0.76g，KH₂PO₄ 0.3g，葡萄糖5g加双蒸水溶解定量至250mL。D-Hanks液：NaCl 8.00g，KCl 0.4g，Na₂HPO₄ 0.06g, NaHCO₃ 0.35g，酚红0.02g，溶于1000mL双蒸水，高温消毒，4℃备用。胶原酶Ⅰ型(Sigma):0.2%，弹性蛋白酶Ⅲ型（Sigma）:0.05%，胰蛋白酶抑制剂（Sigma）:0.05%,牛血清蛋白:0.1%，胰蛋白酶（进口分装）:0.1%，以上均用D-Hanks液配制而后过滤分装。A法仅用胶原酶,B法要用胶原酶、胰蛋白酶抑制剂和弹性蛋白酶。

二、M₁₉₉培养基（美国Gibco）

按说明书配制，加入10 mmol/L HEPES,1 mmol/L谷氨酰胺，加新鲜三蒸水至1000 mL，-20℃备用。使用时加入小牛血清，配成20%和10%的培养基，用后4℃保存。

三、主要方法及操作步骤

1.取心肺组织购自本校实验动物中心的Wistar大鼠［有合格证号，雌雄各半，体重（200±18) g］，用0.4%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后经颈动脉放血处死，无菌迅速取出心肺组织，放入预先装有无血清培养基的直径5 cm培养皿内。

2.取肺主动脉直径5 cm培养皿移入超净工作台，在手术显微镜或解剖显微镜直视下分离出肺主动脉。用弯头眼科镊小心仔细地剥除外膜的纤维脂肪层，并用眼科剪沿血管外侧纵向剪开，在Hanks液中漂洗3次。将血管内膜面向上，铺于小木板上，用刀片自上而下刮1～2次，以去除内皮细胞。

3.消化先用钟表镊撕成1 mm×1 mm左右的小条，放置预先盛有2～3mL的0.2%胶原酶液，盖紧瓶塞，置摇摆仪上37℃ 25次/min振摆12～18h。用复合酶消化法则把1mm²左右的小条放预先盛有内含0.2%的复合消化酶液2mL于37℃ CO₂孵箱培养40min。

4.原代培养 待小块组织完全消化溶解后，1000 r/min离心7 min。弃上清液，向细胞沉淀中加入新鲜配制的20%小牛血清的M₁₉₉培养液，轻轻吹打，后按每瓶（25 mL）3×10⁴活细胞接种在培养瓶里，放入37℃孵箱里静置培养。

5.传代 静置3 d后，贴壁的细胞呈伸展，部分区域已融合生长，培养基的颜色变黄，换新鲜培养基，以去掉没有贴壁的纤维。6～7 d后，细胞长成单层和多层交错的致密细胞层，即可传代。倾去原有液体，加入0.1%胰蛋白酶及0.02% EDTA混合消化液1.5～2.5 mL消化30 s，镜下见细胞成片地收缩，呈颗粒状立即倾去消化液。最后加入10% M₁₉₉培养液，用滴管将细胞自瓶壁上吹打下来，以1∶2分装接种。5d后可再传代。

6.鉴定 用过氧化酶标记的链霉卵白素(slreptaridin/peroxidase,SP)法进行抗α-actin免疫组化染色^［1］，并依常规制做电镜标本进行观察。

四、生长性状的观察

1.计数分析 传至第3代细胞，用胰蛋白酶消化分散后按10⁴/cm²密度接种于每组6孔板，培养9d，逐日检测一组，计数操作见文献^［2］。

2.接种存活率 细胞被制成分散的悬液后，以低密度（2～5个细胞/mm²）被接种到底物上，贴壁并能存活生长形成细胞小群（克隆）的细胞百分数值。用以表示细胞群的活力。

接种存活率=形成克隆数/接种细胞数×100%

五、蛋白质含量测定

以BSA为标准，采用lowry改良法测定PASMC的蛋白质含量，生化试剂购自本校生物化学教研室。

六、胞内［Ca²⁺］含量测定

取汇合成单层的PASMC，弃培养液后用Hanks液冲洗3次，然后用无钙镁含1 mmol/L EDTA的Hanks液温育5 min，细胞从瓶底分离后用Hanks液洗涤3次，然后用培养基制成细胞悬液(10⁶/mL)，并用台盼兰检查细胞存活率＞95%者置4℃保存备用。以Fura-2（中国科学院药物研究所）为荧光指示剂测定细胞内钙释放。负载Fura-2时，向细胞悬液内加入5μmol/mL的Fura-2/AM 37℃温育45 min,以使细胞内Fura-2/AM完全水解为Fura-2。离心弃上清后将细胞悬浮于无钙镁的Hanks液（内含1 mmol/L EGTA）中于2 h内测定。另备未负载Fura-2的细胞以测自身荧光，于37℃恒温稳定后测试。［Ca²⁺］i的荧光检测：激发波长340 nm，发射波长500 nm，光栅5 nm；发射波长510 nm，光栅10 nm，分别加入1% Triton和20 mmol/L EGTA测量大和最小荧光强度。［Ca²⁺］i的计算参照Grynkiewicz等^［3］的方法进行。平行检查5孔。结果采用单因素方差分析。

结果

一、两种消化酶法的特点及价值

用两种方法处理后，单纯酶法要消化11～18 h，一次收集细胞数（1.10～1.34）×10⁶个，有较多的细胞碎片，台盼蓝排斥率为68%～83%，细胞的成片成团率为25%～30%。而复合酶法仅消化0.6～1h，时间明显缩短，收集细胞数高达（6.8～9.5）×10⁶个，且细胞碎片少，仅为单纯酶法的1/4～1/6。细胞成活率为95%～98%，成片成团率也高达50%～63%。复合酶法培养的细胞占有明显优势。

二、PASMC的生长状态

两种培养方法培养的PASMC其生长曲线和蛋白质含量无明显差别，二者均于7～8 d达高峰，而后由于融合抑制而下降。故应选择此时为消化传代的时机。见图1，2。

Fig 1 Growth quantities of PASMC cultured by A or B method

1PASMC的生长情况

Fig 2 Protein content of PASMC cultured by A or B method

2PASMC的蛋白质含量情况

三、PASMC的钙含量

两种酶消化法培养的PASMC，其钙含量有明显差异（P＜0.01）。单纯酶消化法的PASMC的［Ca²⁺］i为（202.00±15.18）nmol/L，而复合酶法为(153.20±11.34)nmol/L。

讨论

近年来，国外文献报道常用复合酶法培养PASMC^［4，5］，但其与单纯酶法的优劣缺少比较。从本研究的结果看，复合酶法确有一些优点。（1）明显缩短消化时间，更具良好的选择性；（2）收获的细胞数量多，对细胞膜的损害程度较轻；（3）成活的细胞数量和质量都有提高；（4）由于酶作用时间短，分离细胞的纯度也有所提高；（5）较好地保护了离体PASMC的性状和代谢。但是应该看到，单纯酶法分离的PASMC与复合酶法相比虽有差距，但不显著，其简便可行，无需配制很多酶液；经济，仅一种酶；技术难度相对的较低，容易掌握和推广。可根据具体情况选用。

本研究还显示两种方法培养的PASMC生长状态、蛋白质含量和［Ca²⁺］i浓度均有差异，故在一种系列研究中应该采用一种方法，不可混用，否则无法进行统计学的分析和比较。

［基金项目］ 国家自然科学基金资助(39700057)

［参考文献］

［1］王关嵩，杨晓静，钱桂生，等. 大鼠血管平滑肌细胞分离培养的探讨［J］. 第三军医大学学报，1998, 20（4）：348～350.

［2］鄂征, 主编. 组织培养和分子细胞学技术［M］. 第1版. 北京：北京出版社，1995. 153～156.

［3］Grynkiewicz G, Poeine M, Tsien RY. A new generation of Ca²⁺ indicators with greatly improved fluor