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［中图分类号］Q487［文献标识码］A
［文章编号］1000-4718(2000)02-0113-04
The effects of rhIL-1β on human fetal islets function and IL-6 production
SUN Rui, TIAN Zhi-gang, ZHANG Jian-hua, ZHANG Jie
( Shandong Cancer Biotherapy Center, Shandong Academy of Medical Sciences, Jinan 250062, China)
［Abstract］AIM: To study rhIL-1β effects on fetal islet function and IL-6 production in vitro.METHODS: Islets from fetal pancreas was separated by collagenase type V (0.5 mg/mL) and cultured in vitro. The islets were exposed to culture medium alone for 48 h or with different concentration of rhIL-1β. The supernatants of culture of human fetal islets were assayed for IL-6, insulin and glucagon.RESULTS:(1) IL-6 activity was increased 4.0 folds (74-294 mU/islet) when islets were exposed to rhIL-1β(20U/mL); (2) IL-6 McAb significantly reduced IL-6 activity in islet supernatants from control group or islet exposed to rhIL-1β treated group; (3)IL-6 mRNA in human fetal islet exposed to rhIL-1β is higher than control in dot hybridization; (4) Soluble insulin and cellular insulin within islet released to supernatants was slightly decreased (0.48～0.78 IU/islet and 0.65～0.79 IU/islet); (5) Glucagon secretion was significantly increased 3.2 folds (1.0～3.2 pg/islet). CONCLUSION: Pancreatic islets produce IL-6 is up-regulated by rhIL-1β. On the other hand, Il-6 produced by the islet may act as a costimulator for autoreactive B and T lymphocytes in autoimmune diabetes.
［MeSH］Human; Embryo; Islets of langerhans; Interleukin-6; Interleukin-1
体外实验表明白细胞介素1(interleukin-1, IL-1)能显著地升高胰岛β细胞的凋亡，并引起胰岛素分泌下降［1］。实验又发现IL-1刺激小鼠胰岛β细胞分泌白细胞介素6(interleukin-6, IL-6)，提示二者在胰岛功能和胰岛依赖型糖尿病(insulin dependent diabetes mellitus, IDDM) 的发病中起不同作用。为了进一步探讨正常人胰岛在IL-1β作用下对IL-6的分泌状况以及对胰岛功能的影响，以便为研究IL-1β和IL-6在IDDM中的可能作用提供依据，我们选择了胚胎期胰岛进行研究。
材料和方法
一、样品的采取和胰岛细胞的分离培养
实验所用样品为自然死亡2 h以内的早产胎儿。按常规方法无菌取出胰腺，胰岛细胞的制备同文献［2］。胶原酶V型为Sigma 公司产品，活性为510 U/mg。
二、人胚胎胰岛细胞培养上清的制备
将胰岛细胞悬液调细胞浓度为5×105/mL，种入24孔板，加入不同浓度重组人白细胞介素1β(recombinant human interleukin-1β,rhIL-1β,1～35 U/mL，购自北京邦定生物医学公司)，同时设相应的对照组，培养48 h后收获上清，测定上清中IL-6、胰岛素和胰高血糖素的含量。
三、胞内胰岛素抽提实验
将新鲜分离的胰岛细胞用Hanks液洗涤后，反复冻融3次，加入酸化乙醇（0.18 mol HCl：无水乙醇=1∶3），置4℃过夜后离心取上清，测定胰岛素含量。
四、IL-6生物活性检测
IL-6生物活性检测为国际通用方法，按文献［3］进行。IL-6依赖细胞株MH60.BSF-2由日本大阪大学细胞工学中心惠赠。rhIL-6为本室产品，纯度为99%，已用IL-6标准品（美国NIH产品）进行标定。用MTT比色法测定A570-630值，用概率单位法计算各样品不同稀释度的生物反应率，最终计算出IL-6的生物效价（mU/mL）。
五、胰岛素和胰高血糖素测定
用北京原子能研究所提供的125I-胰岛素放射免疫分析药盒和胰高血糖素放射免疫测定盒测定。胰岛素的标定单位为mIU/mL，胰高血糖素的标定单位为pg/mL。
六、IL-6单克隆抗体中和活性测定
IL-6单抗为本室建立的杂交瘤细胞株，经过纯化后纯度为98%以上，经实验证明与rhTNF、rhIFN、rhGM-CSF、rhG-CSF和rhIL-2均无交叉反应。用IL-1β刺激的胰岛培养上清，加入不同浓度的IL-6 McAb（0.2～25 μg/mL），同时设rhIL-6 40 U/mL作为阳性对照。每个样品设3个平行孔，用MTT法测定中和活性，中和活性以中和百分数（%）表示。
七、胰岛细胞IL-6 RNA斑点杂交
IL-6 cDNA探针的制备及标记, 胰岛细胞RNA的提取及RNA斑点杂交均按文献［2］进行。
结果
一、rhIL-1β对胚胎胰岛IL-6产生的影响
图1所示，经rhIL-1β刺激的人胚胎胰岛分泌IL-6的能力明显增强，各剂量组与对照组相比IL-6升高的程度均达到显著性水平。当rhIL-1β浓度在10U/mL时，上清IL-6含量为对照组的2.4倍。 当rhIL-1β的浓度在20U/mL时上清IL-6的含量达高峰，为对照组的4.0倍。当rhIL-1β剂量升高至25 U/mL时，上清IL-6的含量开始下降，提示经rhIL-1β刺激的人胚胎胰岛培养上清IL-6含量在一定范围内表现出明显的剂量依赖关系。
Fig 1 Effects of 48 h culture with rhIL-1β on human fetal islets IL-6 production
P＜0.05,P＜0.01,vs control group(0 U/mL)
1不同浓度rhIL-1β作用48 h后人胚胎胰岛IL-6的分泌状况
二、rhIL-1β对胚胎胰岛分泌胰岛素的影响
图2所示，经rhIL-1β刺激的人胚胎胰岛培养上清中胰岛素含量有所下降，当rhIL-1β的浓度在35 U/mL时，上清胰岛素和胞内胰岛素含量均低于对照组，分别为38.56%和18%。
三、rhIL-1β对胚胎胰岛分泌胰高血糖素的影响
图3所示，经rhIL-1β刺激的人胚胎胰岛培养上清中胰高血糖素含量明显升高，当rhIL-1β浓度为10 U/mL时，胰高血糖素分泌量已增加至3.1倍，当rhIL-1β浓度为20 U/mL时，胰高血糖素含量达高峰，为对照组的3.23倍，当rhIL-1β浓度再增高时，胰高血糖素含量开始下降，提示rhIL-1β可呈剂量依赖性促进胰高血糖素分泌，其分泌趋势与IL-6相似。
Fig 2 Effects of 48 h culture with rhIL-1β on human fetal islet insulin release and islet insulin
P＜0.05,P＜0.01, vs control group(0 U/mL)
2不同浓度rhIL-1β作用48 h后人胚胎胰岛胰岛素释放和胞浆胰岛素含量
Fig 3 Effects of 48 h culture with rhIL-1β on human fetal islets glucagon secretion
P＜0.05,P＜0.01,vs control group(0 U/mL)
3不同浓度rhIL-1β作用48 h后人胚胎胰岛胰高血糖素的分泌状况
四、IL-6 McAb对rhIL-1β刺激后的人胚胎胰岛培养上清中IL-6的中和效应（图4）
用IL-6 McAb对rhIL-1β刺激的胰岛和对照组胰岛的培养上清中IL-6的中和试验证明IL-6 McAb可以特异性中和上清中IL-6对依赖细胞株的促增殖效应，并且反证rhIL-1β刺激组中IL-6含量高于对照组。
