［摘要］目的：初步探讨人中性粒细胞（PMN）抑制U937细胞肿瘤坏死因子-α(TNF-α)生成的机制。方法：将人PMN与经PMA刺激分化为单核细胞样细胞的U937细胞在不同条件下共同培养，取上清测定TNF-α含量。结果：PMN与U937细胞共同培养可抑制U937细胞生成TNF-α。PMN的抑制作用可被低剂量叠氮钠(10～15 μmol/L)部分逆转达45%。该剂量叠氮钠并不影响U937细胞产生TNF-α。叠氮钠的作用机制并非抑制了PMN的髓过氧化物酶活性，因为髓过氧化物酶本身或其它髓过氧化物酶抑制剂三氮杂茂和4-氨基苯甲酰肼对U937细胞产生TNF-α的能力及PMN的抑制作用均无明显影响。结论：PMN对吞噬细胞TNF-α生成的抑制性调节作用是一种细胞间的相互作用。叠氮钠可作为一种有用的试剂供深入研究这种抑制作用的机制。

［中图分类号］R392.32［文献标识码］A

［文章编号］1000-4718(2000)02-0102-03

Mechanism of the inhibitory effect of polymorphonuclear leukocytes on the production of tumor necrosis factor in human phagocytic cells

YAN Liang

(Department of Pathophysiology, Medical College of Jinan University, Guangzhou 510632, China)

［Abstract］AIM: To study the mechanism of the inhibitory effect of human polymorphonuclear leukocytes (PMN) on the production of tumor necrosis factor-α (TNF-α) in U937 cells. METHODS: PMA differentiated U937 cells were cocultured with PMN in the presence of lipopolysaccharide. Sodium azide was added in the culture. The supernatants of cell culture were collected and TNF-α was assayed with ELISA. RESULTS:The inhibitory effect of PMN on the production of TNF-α in U937 cells was observed. Sodium azide restored the TNF-α production in U937 cells/PMN coculture to the extent of 45% in concentration of about 10～15 μmol/L. These concentrations of sodium azide did not affect TNF-α production by U937 cells. The restoration effect of sodium azide on PMN inhibition was not related to blocking of myeloperoxidase (MPO) activity. The MPO inhibitors 3-amino-1,2,4,-triazole and 4-aminobenzoyl hydrazide had few effect on PMN inhibition. CONCLUSION: These results indicated that PMN inhibition depended on the cell-cell interactions. Sodium azide may be a useful reagent for further studying this mechanism.

［MeSH］Neutrophils；Phagocytes；Azides; Tumor necrosis factor

最近作者报道了高纯度的人中性粒细胞（polymorphonuclear leukocytes, PMN）体外培养不产生肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)，相反，PMN能抑制U937细胞生成TNF-α。PMN的抑制作用呈数量依赖性。PMN必须与U937细胞直接接触才能产生抑制作用。初步观察表明，此抑制作用与一氧化氮信息传导通路无关，内外源性一氧化氮对PMN的抑制作用均无影响^［1］。以上结果说明，PMN不仅是机体重要的防御细胞,负责吞噬和清除致病原及感染物，而且是机体重要的免疫调节细胞，通过细胞与细胞间的相互作用，对机体产生的TNF-α这一重要细胞因子起负调节作用。本研究进一步探讨PMN这一负调节作用的可能机制。

材料和方法

一、人中性粒细胞的分离、细胞培养和TNF-α测定均按照文献^［1］的方法进行。U937细胞用RPMI 1640(含25 mmol/L HEPES)＋10％胎牛血清培养。调细胞浓度为5×10⁵/孔于24孔培养板，每孔置1.5 mL含有100 nmol/L佛波酯（phorbol myri-state acetate, PMA）的RPMI 1640培养48 h，用无钙，镁的Hank液洗两次，重新置于1 mL无PMA的新鲜培养基（内含LPS，浓度为1 μg／mL）中继续培养24 h，离心取上清，ELISA法测定TNF-α含量。为了观察PMN对U937细胞产生TNF-α的影响，加入5×10⁶个细胞的PMN于U937细胞中共同培养。24h后离心取上清测定TNF-α含量。以上实验均同时设置相同细胞数的单纯PMN对照组。

二、在上述共同培养体系中分别加入髓过氧化物酶（myeloperoxidase, MPO），叠氮钠（sodium azide），或叠氮化合物类髓过氧化物酶抑制剂三氮杂茂(3-amino-1,2,4,-triazole, 3A)^［2］和非叠氮化合物类髓过氧化物酶抑制剂4-氨基苯甲酰肼(4-aminobenzoyl hydrazide, 4A)^［3］，观察其对U937细胞产生TNF-α的能力及PMN的抑制作用的影响。

三、所有数据均用均数±标准差(±s)表示。各组内均数差异显著性用双侧t检验比较，各组间的均数差异显著性用Bonferroni校正的双侧t检验比较。

结果

一、U937细胞经PMA刺激分化后，在脂多糖作用下，产生大量TNF-α。加入PMN共培养，U937细胞的TNF-α生成受到明显抑制 (P＜0.01)（图1）。在PMN（5×10⁶ cells）与U937细胞（5×10⁵ cells）共培养体系中分别加入蛋白酶抑制剂aprotinin(丝氨酸蛋白酶抑制剂), pepstatin (天冬氨酸蛋白酶抑制剂),E-64(半胱氨酸蛋白酶抑制剂),胰蛋白酶抑制剂等，均未观察到对PMN的抑制作用产生影响。

Fig 1 The restoratory effect of sodium azide on the PMN inhibition of TNF-α production by U397 cells (n=5)

1叠氮钠对PMN抑制U937细胞产生TNF-α的逆转作用

Fig 2 Effect of MPO on the PMN inhibition of TNF-α production by U937 cells (n=4) MPO: myeloperoxidase

2髓过氧化物酶对PMN抑制U937细胞产生TNF-α的影响

二、叠氮钠（0～25 μmol/L）对U937细胞产生TNF-α无影响，但能逆转PMN对U937细胞生成TNF-α的抑制作用。从图1可见，在有5×10⁶ PMN共同培养的条件下，随着叠氮钠浓度的提高，PMN的抑制作用逐渐减弱，最大效应在10～15 μmol/L，可逆转PMN的抑制效应达45%，继续加大浓度效应不再增加。此浓度叠氮钠未见细胞毒性，对U937细胞产生TNF-α无影响。

Fig 3 Effect of MPO inhibitors on the PMN inhibition of TNF-α production by U397 cells (n=4)

3A:3-amino-1,2,4-triazole

4A:4-aminobenzoyl hydrazide

3髓过氧化物酶抑制剂对PMN抑制U937细胞产生TNF-α的影响

三、髓过氧化物酶（0～1?000 mU/mL）在有无叠氮钠的情况下均不影响U937细胞产生TNF-α，与对照组相比无明显差异(P＞0.05，图2)。叠氮化合物类髓过氧化物酶抑制剂三氮杂茂(3-amino-1,2,4,-triazole, 3A)和非叠氮化合物类髓过氧化物酶抑制剂4-氨基苯甲酰肼(4-aminobenzoyl hydrazide, 4A)并不影响U937细胞产生TNF-α，也不产生类似叠氮钠对PMN抑制U937细胞产生TNF-α作用的逆转效应（图3），说明髓过氧化物酶并非PMN抑制U937细胞产生TNF-α的效应分子，叠氮钠的逆转效应不是通过抑制PMN的髓过氧化物酶活性发生作用的。

讨论

本文在观察到PMN与人吞噬细胞U937相互作用时抑制U937细胞产生TNF-α的基础上，进一步研究其作用机制，发现叠氮钠能部分逆转PMN对U937细胞产生TNF-α的抑制作用，此逆转效应并非是抑制了PMN中的髓过氧化物酶活性而产生的。

单核吞噬细胞在某些信号分子的激活作用下，生成和分泌可溶性的TNF-α分子，其过程十分复杂，细胞信息传导通路尚未完全明了。PMN是含有和能释放多种蛋白酶的细胞，这些蛋白酶在PMN与其它细胞或病原体相互作用时发挥重要作用。然而从本实验的初步结果看，所测试的多种蛋白酶抑制剂并未改变PMN对U937细胞产生TNF-α的抑制作用。最近有文献报道这些蛋白酶抑制剂对抑制游离在溶液中的蛋白酶活性较为有效，但对PMN膜上的蛋白酶分子的活性不敏感，需要使用分子量更小的抑制剂方能发挥作用^［4］。这可能是本实验未能观察到这些蛋白酶抑制剂对PMN的负调节作用有任何影响的原因之一，值得进一步深入研究。

本实验观察到叠氮钠可部分逆转PMN对U937细胞产生TNF-α的抑制作用。由于PMN富含髓过氧化物酶，而叠氮钠又常用于抑制髓过氧化物酶活性，推测PMN可能通过髓过氧化物酶抑制TNF-α的生成。作者的实验结果表明，髓过氧化物酶并不影响U937细胞生成TNF-α，而叠氮化<