［摘要］目的：探索水稻苯丙氨酸氨解酶基因在大肠杆菌中的表达及其规律，为治疗苯丙酮尿症奠定基础。方法：应用基因工程技术，将水稻苯丙氨酸氨解酶的cDNA(rPAL-1-cDNA）重组入大肠杆菌高效表达质粒pET-28c，通过异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导，在大肠杆菌中获得表达。结果：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳表明，诱导1，3，5，7 h后，表达蛋白量占菌体总蛋白分别为21.40%, 30.60%, 35.40%, 35.43%，融合蛋白His6-rPAL分子量为78.6 kDa，主要以包涵体形式存在。结论：建立了水稻苯丙氨酸氨解酶基因的大肠杆菌表达株。

［中图分类号］Q786［文献标识码］A

［文章编号］1000-4718(2000)01-0012-05

Expression of phenylalanine ammonia-lyase cDNA from rice in E. coli BL21DE3

CAI Zhu-nan, YU Ying-nian, LUO Jian-hong, QIAN Yu-li, CHEN Xiang-ruo

(Depatment of Pathophysiology, Medical School, Zhejiang University, Hangzhou 310031, China)

［Abstract］ AIM: To study the expression and its kinetics of rice phenylalanine ammonia-lyase gene encoding into E. coli as the basis of treatment for phenylketouria. METHODS: The phenylalanine ammonia-lyase-1-cDNA(rPAL-1-cDNA) from rice was recombined into E. coli high expression vector pET-28c and transformed into E. coli host strain BL21DE3. Engineering bacteria was then inducted by isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) for 1, 3, 5, 7 hours, in order to obtain high level expression. RESULTS: After induction, the expression level of fusion protein was 21.40%, 30.60%, 35.40%, 35.43% respectively. The fusion protein exhibited a band of 78.6 kD on SDS-PAGE analysis,but was not found in controls.The target protein was mainly existed in the form of inclusion body. CONCLUSION:Rice PAL gene expressing E. coli was established by gentic engineering technique.

［MeSH］ Phenylalanine ammonia-lyase; Gene rearrangement; Plasmid; Escherichia coli

遗传性缺乏苯丙氨酸羟化酶所致的苯丙酮尿症是人类常见的先天性苯丙氨酸代谢缺陷病，是引起先天性智力降低的主要原因之一。为防止痴呆的发生，在出生后至发育期必需服用不含或含极少量苯丙氨酸的合成食物，费用十分昂贵。用酶在肠道内/外将消化后的苯丙氨酸降解，是一个有希望的取代途径。苯丙氨酸氨解酶(L-phenylalanine ammonia lyase, PAL)广泛分布于植物和某些真菌中^［1］，它可使苯丙氨酸降解为无毒的苯丙烯酸。在动物实验中证明，口服该酶可降低实验性苯丙酮尿症动物血清中异常增高的苯丙氨酸浓度^{［2, 3］}，已有学者研究将该酶固化后，口服用于治疗苯丙酮尿症^{［4, 5］}。尽管PAL在临床治疗应用中具有良好的前景，但无法从真菌和高等植物细胞中大量提取PAL，为此，试图应用基因工程技术探索从大肠杆菌中获取大量廉价的PAL，藉以通过口服在肠道内消除苯丙氨酸，或用于生产廉价的无苯丙氨酸食物，达到治疗苯丙酮尿症的目的。

材料和方法

一、菌株和质粒：

大肠杆菌DH5α和BL21DE3为本实验室保存；pUC19-rPAL-cDNA质粒由日本国立农业生物研究所Ei-ichi Minami博士惠赠；质粒pET-28a,b,c

为美国Novagen公司产品。

二、酶及主要试剂：

EcoR I为德国Boehringer Mannheim公司产品；BamH I, IPTG为日本Takara公司产品；牛小肠碱性磷酸酶（CIP），T₄DNA连接酶，丙烯酰胺及亚甲基双丙烯酰胺为美国Promega公司产品；DNA分子量标准λDNA/Hind Ⅲ及中分子量标准蛋白质购自上海生工生物工程公司；N, N, N', N'-四甲基乙二胺（TEMED）为美国Bio-Rad公司产品；引物5' TGGATCTTGACCAGCGGCT 3'由上海生工生物工程公司合成；测序试剂Terminator cycle sequence kit购自美国Perkin Elmer公司。

三、pUC19-rPAL-1-cDNA部分测序及表达载体的选择：

按文献^［6］，将质粒pUC19-rPAL-1-cDNA转化大肠杆菌DH5α，并加以扩增。根据文献^［7～9］在水稻苯丙氨酸氨解酶基因（GenBank/EMBL, Accession number: x16099）ATG下游131-112碱基段设计测序引物5' TGGATCTTGACCAGCGGCT 3'，对pUC19-rPAL-1-cDNA质粒进行反向测序。测序按Perkin Elmer公司推荐的BigDye标记终止碱基双脱氧法在ABI Prism^TM310自动序列分析仪上进行。根据测序结果，在表达质粒pET-28系列中，选择与之相匹配的表达载体。

四、表达质粒的构建：

用EcoR I酶将pET-28c从多克隆位点处切开，在其5'端用牛小肠碱性磷酸酶（CIP）脱去磷酸，纯化后溶于双蒸水中备用。

用EcoR I酶切质粒pUC19-rPAL-1-cDNA，通过1.5%琼脂糖凝胶电泳分离（80V 4 h），切取2.5kb的rPAL-1-cDNA条带，用透析袋法回收，经酚、氯仿抽提，乙醇沉淀纯化，溶于双蒸水。

按文献^［6］描述步骤用T₄DNA连接酶将2.5kb rPAL-1-cDNA与5'端脱磷酸之线性pET-28c连接重组成表达质粒，连接时取插入片段DNA与pET-28c DNA的摩尔比为3∶1。连接产物转化感受态大肠杆菌BL21DE3, 在含有卡那霉素的LB平板上,筛选出阳性克隆。

五、鉴定插入方向：

根据rPAL-1-cDNA及pET-28c酶切图谱，选用BamH I酶切重组质粒，鉴定插入方向。并用测序引物对重组质粒PET-28c-rPAL-1-cDNA进行测序，进一步确定其插入方向及阅读框架。

六、工程菌的诱导表达及SDS-聚丙酰胺凝胶电泳分析：

挑取正向插入克隆，接种于含50 μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养16 h,以1∶200比例接种于新鲜的含抗生素的培养基中, 37℃振荡培养2.5 h进行扩增,取100 mL菌液作为诱导前对照。然后加入终浓度为1 mmol/L的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，在37℃振荡培养中诱导工程菌表达,分别于诱导1,3,5,7 h四时间点取样,以BL21DE3及经pET-28c空载体转化的BL21DE3为对照，在超声裂解液中将大肠杆菌超声破碎，200 W 10 s，停10 s，重复10次。4 ℃ 15 000 r/min离心15 min，上清液和沉淀分别进行10% SDS-聚丙酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，200 V，30 min，考马斯亮兰染色，结果经Kodak digital science^TM电泳扫描仪分析确定其分子量及蛋白表达量。

Fig 1 The partial sequence of pET-28a, b, c, pUC19-rPAL-1-cDNA and expected recombinant expression plasmid pET-28c-rPAL-1-cDNA

1 pET-28a, b, c, pUC19-rPAL-1-cDNA及预期重组表达质粒pET-28c-rPAL-1-cDNA部分序列

结果

一、表达质粒pET-28系列的选择：

应用测序引物对质粒pUC19-rPAL-1-cDNA进行部分测序，结果见图1。从rPAL-1-cDNA序列中首先找出翻译起始密码ATG，根据3个碱基编码1个氨基酸的原则，由此往上推算可知，要求表达载体在EcoR I接头处的三联体结构必需具备与之相匹配的ATT框架。对比大肠杆菌表达质粒pET-28a, b, c部分序列，发现在重组后，能保持正确阅读框架，而不发生移码的只有pET-28c符合要求。若rPAL-1-cDNA正向插入pET-28c 多克隆位点上的EcoR I位点，预期重组后的表达质粒部分序列应如图1所示。

二、重组表达质粒构建及酶切分析：

rPAL-1-cDNA大小为2519 bp，pET-28c大小为5367 bp，通过T4 DNA连接酶连接后的重组表达质粒应为7886 bp。挑取四个重组阳性克隆，经EcoR I酶切图谱鉴定，所得片段符合预计大小（见图2，lane2, 4, 6, 8）。由于应用单酶切插入目的基因所获得的重组质粒，存在着正反两种插入方向。为了获得所需的正向插入重组克隆，经查阅GenBank, 在对rPAL-1-cDNA及pET-28c质粒的酶切图谱分析后，选用各自都只有一个酶切位点并能显著区分正反插入方向的BamH I进行酶切鉴定。根据理论分析，经BamH I酶切后可能出现的二种情况如下：正向插入生成的二个片段大小预计应为337bp和7549 bp，反向插入分别为2194 bp和5692 bp（见图3）。四个重组克隆的BamH I酶切图谱见图2，lane 1, 3, 5, 7。由此可知，获得了3个正向插入重组克隆和1个反向插入重组克隆。

三、重组质粒测序：

重组表达质粒测序结果如图4所示，与设计时预期的完全相同。说明该重组质粒已正向插入目的基因，对阅读框架分析，完全肯定了该质粒能正确表达rPAL-1-cDNA。

四、10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及扫描分析：

以大肠杆菌BL21DE3和经pET-28c质粒转化的BL21DE3为对照，与经pET-28c-