［摘要］ 目的：获得纯化抗原用于制备CYP2B6多克隆抗体。方法： PCR扩增目的基因片段，亚克隆入融合蛋白表达载体pGEX-3b，构建了重组质粒pGEX/2B6。然后将该重组质粒转化大肠杆菌DH5α，IPTG诱导表达，SDS-PAGE分离，获纯化融合蛋白GST-2B6。用GST-2B6免疫BALB/C小鼠，自腹水中获取CYP2B6多克隆抗体（2B6pAb）。结果：融合蛋白GST-2B6（CYP2B6 202～352 aa），并获其特异的多克隆抗体。结论：通过构建融合蛋白重组表达质粒pGEX/2B6，用获得的初步纯化融合蛋白GST-2B6制备了特异的2B6pAb。

［中图分类号］ Q 754［文献标识码］ A

［文章编号］1000-4718(2000)01-0003-05

Expression of GST fusion proteins of human cytochrome P 2B6 and preparation of anti-cytochrome P2B6 polyclonal antibody

LIN Xiao-jie, LUO Jian-hong, YU Ying-nian

(Department of Pathophysiology, Zhejiang Medical University, Hangzhou 310031, China)

［Abstract］AIM: To get large amounts of pure antigens to raise specific antibodies and to perform quantifications.METHODS: CYP2B6 (cytochrome P) cDNA fragments was ligated into BamHI restricted PGEX-3b to generate recombinants PGEX/2B6. We identified recombinants PGEX/2B6 by EcoRI digestion. The expression of fusion proteins were induced by adding isopropyl-thiogalactoside(IPTG). Several clones showed high-level expression of fusion proteins. Insoluble proteins was isolated from the bacteria and the fusion proteins was recovered and purified from a preparative (2mm) SDS-PAGE. The polyarcrylamide gel containing the fusion proteins glutathione S-transferase(GST-2B6) were used to immunize BALB/C mice from which polyclonal ascites fluid was prepared. The purified fusion proteins GST-1A1（GST fusion protein of CYP1A1 cDNA246～386aa expressed in this library ,purified by preparative SDS-PAGE）, GST-2B6 were used to test the specificity of 2B6pAb. RESULTS:Fusion proteins constructed between GST and CYP2B6 was expressed in Escherichia coli DH5α. Mouse antibodies are raised against the fusion proteins GST-2B6. 2B6pAb was fond to be specific antibody.CONCLUSION:Recombinant PGEX/2B6 were constructed and purified fusion proteins GST-2B6, and specific 2B6pAb were obtained.

［MeSH］ Cytochrome P-450; Recombinant, fusion proteins; Antibodies

细胞色素P450（cytochrome P, CYP）是由100多个基因组成的超家族氧化还原酶系^［1］。哺乳动物中有12个家族,22个亚家族和众多个体基因。CYP介导化学致癌物的代谢活化，这是始动化学致癌的至关重要的第一步。其中CYP1-4家族尤为重要。因而研究CYP1-4家族同功酶及其功能特征是一重要课题。

但CYP2B6在组织中的表达量很低（仅占肝CYP总量的2%），又有种属、性别、年龄、组织和细胞分布差异，同一亚家族的酶类性质及结构相近，难以直接分离纯化CYP酶蛋白作研究。制备特异性的CYP2B6抗体则为研究CYP2B6表达和功能特征的另一有效手段。

用生化的方法直接从组织中分离纯化CYP酶蛋白往往繁琐而困难，且难以获得足够量的纯化CYP酶蛋白作为抗原。本研究拟体外表达CYP2B6基因片段，以获得足够量的纯化抗原，并制备CYP2B6特异性抗体。曾有人体外表达一组CYP2B6基因片段（长18～33aa）用于制备CYP2B6抗体，也证明了我们选用的包括特异肽段。国内外尚无市售的CYP2B6抗体。

材料和方法

一、表达菌株、克隆载体、模板DNA：

DH5α、融合蛋白表达性载体pGEX-3b、PEE-2B6。pGEX-3b ，4966bp，含氨苄青霉素抗性基因和GST的氨基末端基因，由pGEX-3X（Phamacia）改造而来^［2］。PEE-2B6为本科室自行构建，为CYP2B6 cDNA（1468bp，PCR产物）与pREP9载体的重组质粒,并命名为PEE-2B6^［3］。

二、主要试剂：

工具酶（Gibco/BRL、Promega），PCR引物（上海细胞所塞尔公司合成），柱离心式胶回收试剂盒（上海华顺公司）；强化的化学发光检测系统（enhanced chemiluminescence detection system, ECL）自行配制，辣根过氧化物酶(HRP)交联的抗小鼠第二抗体购于华美生物公司。

三、免疫对象和细胞株：

BALB/C小鼠（ 8周，雌性），小鼠骨髓瘤细胞株NS-1（上海细胞所）。

四、目的基因片段的获取及重组质粒pGEX/2B6的构建：

(1)PCR引物设计策略：据Genbank检索分析选择表达CYP2B6 202～352aa这一特异肽段。据对应的DNA序列（CYP2B6 cDNA 610～1060bp），并考虑到其BamHI位点（带下划线序列）的阅读框架GAT（方框内序列）与克隆载体pGEX-3b相符而设计引物如下：

(2)PCR扩增反应：反应体系参照文献4。循环94℃变性1 min，65℃退火2 min，72℃聚合3 min。循环25次。

(3)重组质粒pGEX/2B6的构建： 选用EcoRI酶切来鉴定目的基因片段的插入取向。DNA制备采用碱裂解法。用柱离心式胶回收试剂盒回收纯化目的DNA。酶切、载体DNA的去磷酸化、连接反应、感受态细胞的制备及转化均按常规方法进行^［4］。

五、GST-2B6的诱导表达及切胶纯化：

(1)重组质粒pGEX/2B6的诱导表达：将重组质粒pGEX/2B6转化入表达菌株DH5α，过夜菌1：50稀释入新鲜培养基，培养至0D₆₀₀～0.75,加1 mmol/L IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷酶）诱导表达（37℃，300 r/min剧烈振摇）。分别于诱导表达前、诱导表达后1 h、2 h、3 h、4 h取样，进行0.1%SDS-10%PAGE^［5］(200V 45min) ，经0.25%考马斯亮兰染色，观察结果。

(2) GST-2B6的切胶纯化：收集诱导表达细菌，加入原体积的缓冲液，反复超声粉碎，离心并定量转移上清至另一管，即为上清样品（S）；用同量的缓冲液悬浮沉淀样品，即为沉淀样品（I）。上述缓冲液均为含1% Triton X-100的MTPBS［150 mmol/L NaCl,16 mmol/L Na₂HPO₄, 4 mmol/L NaH₂PO₄(pH 7.3)］^{［ 6］}。切胶纯化程序如下：先将溶于加样缓冲液中并煮沸变性的诱导表达细菌经制备型（2 mm）0.1%SDS-10%PAGE分离， 0.3 mol/L CuCl₂溶液显色，切取含GST-2B6的PAGE胶块。用脱色液［0.25mol/L EDTA（pH 8.0），0.25 mol/L Tris-HCl(pH 9.0)］脱色， MTPBS平衡过夜、冷冻干燥，碾磨成胶粉^［7］，取适量胶粉即为纯化样品（P）。上述样品经0.%SDS-10%PAGE分离及考马斯亮兰染色，观察结果。

六、多克隆抗体的制备和初步鉴定：

(1） 多克隆抗体的制备：称取含相应量GST/2B6的胶粉重悬于生理盐水中，直接用于免疫小鼠^［8］。以生理盐水作为对照。在加强注射后腹腔注射NS-1细胞以促进腹水生成。收集腹水，获取多克隆抗体2B6pAb。免疫程序如下:

第1、14、28 d腹腔注射50 μg抗原/每只小鼠；第3、17 d腹腔注射0.3 mL弗氏不完全佐剂/每只小鼠； 第31 d腹腔注射NS-1细胞 5×10⁵细胞/每只小鼠； 第42～45 d收集腹水。

(2)用融合蛋白免疫印迹反应初步鉴定2B6pAb的特异性^［9］：

①纯化的融合蛋白GST-1A1（本实验室自行制备，为CYP1A1蛋白246～386 aa与GST的融合蛋白，切胶纯化）、GST-2B6均用加样缓冲液重悬，煮沸3 min。高速离心后吸取上清作倍比稀释，使每孔的加样量分别为200、100、50和25 ng。

②2B6pAb用经切胶纯化的GST-1A1融合蛋白交叉吸收过夜。同时对未经交叉吸收的2B6pAb进行实验。

③按常规方法进行GST-1A1、GST-2B6的0.1%SDS-10%PAGE^［5］和电转膜^［10］。

④用［含5%脱脂奶粉的TBST（20 mmol/LTris-HCl,140 mmol/L NaCl,0.1% Tween-20）］封闭硝酸纤维素膜上非特异位点。

⑤加2B6pAb (1∶50稀释入封闭液)室温反应2 h，TBST漂洗。

⑥加HRP标记抗小鼠第二抗体(1∶200稀释入封闭液)室温反应2h，TBST漂洗。

⑦最后加ECL溶液，使抗原抗体复合物条带曝光为X光底片相应位置上的条带，经显影、定影后，观察结果。

结 果

一、目的基因片段的PCR扩增及重组质粒pGEX/2B6的构建：

10 μL PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳分离、EB染色，在约458bp处可见明亮的DNA条带，与设计产物大