［摘要］目的：探讨NF_κB在大鼠肺微血管内皮细胞iNOS基因诱导表达中的作用及抗氧化剂对内皮细胞iNOS诱导表达的影响及其机制。方法：Griess法测定细胞培养上清液NO^-_２水平以反映NO的生成，Northern印迹分析iNOS mRNA水平，EMSA法测定细胞核内NF_κB的结合活性。结果：抗氧化剂可阻断内皮细胞培养体系LPS和TNFα诱导的NO生成及iNOS mRNA的表达；LPS和TNFα可诱导大鼠肺微血管内皮细胞NF_κB的激活并可被抗氧化剂阻断。结论：LPS和TNF α诱导的内皮细胞iNOS基因表达依赖于NF_κB的激活；抗氧化剂可通过抑制NF_κB的活化而阻断iNOS基因的诱导表达。

［中图分类号］R318.04［文献标识码］A

［文章编号］1000-4718(2000)01-0020-04

Effect of antioxidant and NF_κB on the induction of iNOS gene in rat pulmonary microvascular endothelial cells in vitro

LIU Qing-hang, JIN Hui-ming, WU Zhao-hui, CHEN Yu, LIU Kai

(Department of Pathophysiology, Shanghai Medical University, Shanghai 200032, China)

［Abstract］ AIM:To investigate the role of nuclear factor κB (NF_κB) in the induction of iNOS gene by TNFα and LPS in endothelial cells and the effect of antioxidant on the induction of iNOS. METHODS:Nitrite was determined based on Griess reaction. iNOS mRNA was analyzed using Northern blot. NF_κB in the cell nucleole was detected with electrophoretic mobility shift assay.RESULTS:(1)NO production and iNOS mRNA expression induced by LPS and TNFα was blocked by pyrrolidine dithiocarbamate(PDTC) or N-acetylcysteine(NAC). (2)LPS and TNFα triggered the activation and translocation of NF_κB, and PDTC or NAC inhibited the activation of NF_κB induced by LPS and TNFα.CONCLUSIONS:(1)The induction of iNOS gene by TNFα and LPS is dependent on the activation of NF_κB.(2)Antioxidants may inhibit the induction of iNOS gene through the inhibition of NF_κB activation.

［MeSH］Nitric Oxide; Antioxidants; Endothelium

内皮细胞在多种细胞因子或内毒素作用下表现出一些新的特性，如细胞表面粘附分子及主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)抗原的表达，产生一系列细胞因子及诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)的表达，使内皮参与活跃的免疫反应，此过程称为内皮细胞的激活^［1］。内皮细胞的过度激活将导致内皮细胞出现一系列表型变化并产生如动脉粥样硬化和类风湿性关节炎等。其中内皮细胞iNOS的过度表达所致的内皮细胞低反应性及内皮细胞的损伤在炎症、免疫性疾病及内毒素休克的发病过程中具有重要意义。

研究表明内皮细胞激活时iNOS表达的调控主要发生在转录水平。iNOS基因的启动子区域含有多个转录因子的结合位点包括NF_κB、AP-1、NF-IL6，Oct-1等^［2］，而核因子κB(nuclear factor κB, NF_κB)被认为在多种参与炎症反应的蛋白质因子的基因调控中担任重要角色，因而可能是内皮细胞激活的调控中一个重要转录激活因子^［2，3］。据报道巨噬细胞，肾系膜细胞中iNOS的表达依赖于NF_κB的活化，但NF_κB与内皮细胞iNOS基因诱导表达的关系报道较少。本文探讨NF_κB在大鼠肺微血管内皮细胞iNOS基因诱导表达中的使用。另外，抗氧化剂被认为是NF_κΒ活化的有效抑制剂，因而，本文亦研究抗氧化剂对于LPS和TNFα诱导的内皮细胞iNOS表达的影响及其机制。

材料和方法

一、材料：

重组人肿瘤坏死因子-α(recombined human tumor necrosis factor-α， TNF-α)，大肠杆菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)，pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC)，N-acetylcysteine(NAC)购自Sigma公司，无酚红DMEM培养基，小牛血清购自Gibco公司，Dig High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit Ⅱ, Dig Gel Shift Kit购自Boehringer Manhaim公司。

二、方法：

(一)细胞培养：大鼠肺微血管内皮细胞的分离培养参照我们以往报道的方法^［4］。选用体重100 g左右的雄性SD大鼠，乌拉坦腹腔注射麻醉，腹腔内注射肝素(1000 U/100 g BW)，左心室切口，从右心室缓慢灌注10 mL D-Hanks液至肺叶颜色变白。小心剪取边缘肺组织，进而剪切成1 mm×1 mm×1mm小块，按1～2块/cm^２密度接种于培养瓶，用含20%小牛血清的DMEM培养液培养60～70 h后去除组织块，换液，直至长成致密单层。此细胞已应用抗vWF抗体及内皮细胞抗体CD31进行免疫组化鉴定并应用相差显微镜和电镜进行形态鉴定，非内皮细胞少于5%^［4］。使用传代至2～3代的细胞，细胞在加入药物处理前12 h所用培养液血清浓度降为0.5%。进行NO^_２水平测定用的细胞培养体系使用无酚红DMEM培养基。

(二)NO水平的测定：根据Griess反应原理，用我室改良的方法测定细胞培养上清液中NO^_２水平以反映NO的生成^［4］。培养上清液经离心后取100 μL加入等量的Griess反应液［1%磺胺；0.1% N-1-萘乙二胺(溶剂为5%磷酸)］混匀，室温放置10 min，应用酶标比色仪Biorad 450于540 nm处进行光密度测定，根据标准曲线换算为NO^-_２浓度。

(三)探针的制备与标记：应用RT-PCR方法制备用于Northern杂交的探针^［5］。所用的引物序列为：(1)GAPDH：5’-AGA TCC ACA ACG GAT ACA TT-3’；5’-TCC CTC AAG ATT GTC AGC AA-3’；(2)iNOS:5’-GTG TTC CAC CAG GAG ATG TTG-3’；5’-CTC CTG CCC ACT GAG TTC GTC-3’。所得的PCR产物经低溶点琼脂糖凝胶分离并纯化用以制备探针。探针的标记应用“Dig High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit Ⅱ”试剂盒，按说明书进行地高辛随机引物法标记并检测标记效率。

(四)Northern印迹分析：细胞总RNA抽提采用文献报道的一步法，1%琼脂糖-甲醛变性胶电泳，毛细管法转移至尼龙膜，预杂交3 h，杂交过夜，洗膜。应用“Dig High Prime DNA Labeling and Detection Start Kit Ⅱ”试剂盒检测，至观察到蓝紫色条带后即终止反应。条带经光密度扫描，将比值(iNOS mRNA/GAPDH mRNA)进行统计分析。

(五)EMSA(electrophoretic mobility shift assay)：核蛋白的提取参照Singh等的方法^［6］。核蛋白质定量采用考马斯亮兰G-250染色法。NF_κB识别的特异性双链DNA序列5’-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3’采用地高辛标记，步骤参见“Gel Shift Kit”说明。取4 μg核蛋白质与标记的双链探针混合，室温下孵育30 min，然后进行6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，缓冲液为0.25×TBE， 4℃电泳2～3 h，电泳后的凝胶转移至尼龙膜，固定，应用“Dig Gel Shift Kit”试剂盒进行检测。

(六)统计分析：数据以±s表示，应用t检验测试均数差异显著性。

结果

一、抗氧化剂可阻断内皮细胞培养体系NO的诱导生成：

大鼠肺微血管内皮细胞经LPS(1 μg/mL)和TNFα(100 U/mL)作用24 h后，细胞培养上清液NO^_２水平显著高于对照组(P＜0.01， n=5)。提示LPS及TNFα可诱导大鼠肺微血管内皮细胞NO的生成。而在培养体系预先加入抗氧化剂PDTC(0.1 mmol/L)或NAC(20 mmol/L)1.5 h则可显著抑制LPS及TNFα诱导的NO的生成(P＜0.01，n=5)(图1A)。另外，抗氧化剂PDTC及NAC对内皮细胞NO诱生的抑制作用呈现剂量-效应关系(图1B，C)。

Fig 1Accumulation of nitrite in rat pulmonary microvascular endothelial cells(RPMECs) culture medium(A)RPMECs were treated with LPS(1 μg/mL)+TNFα (100 U/mL) for 24 h, or preincubated for 1.5 h with PDTC (0.1 mmol/L) or NAC (20 mmol/L) then for the next 24 h with LPS(1 μg/mL)+TNFα(100 u/mL).(B)RPMECs were preincubated with various concentrations of PDTC for 1.5 h and for the next 24 h with LPS (1 μg/mL)+TNFα(100 U/mL).(C)RPMECs were preincubated with various concentrations of PDTC for 1.5 h and for the next 24 h with LPS(1 μg/mL)+TNFα(100 u/mL)

1大鼠肺微血管内皮细胞培养上清液NO^_２水平的变化

二、LPS和TNFα可诱导大鼠肺微血管<