［中图分类号］ Q 786［文献标识码］ A

［文章编号］1000-4718(2000)01-0088-04

Studying progression in gene p73

LIU Yong-yi, ZHONG Xue-yun

(Department of Pathology, Medical College of Jinan University, Guangzhou 510632, China)

【A Review】 p73, a first p53 relative, has recently been identified as a new structural and functional homologue of the transcription factor p53. However, it is unclear whether this protein functions as a tumor suppressor. p73L, a second human p53-related gene, which shows strong amino-acid similarity to p73. In this article, we shall discuss the cloning, location, expression and functions of these two new candidate tumor suppressor genes and look forward to the future study.

［MeSH］Genes; Genes, structural; Genes, suppressor,tumor

随着对肿瘤基因的深入研究，越来越多的抑癌基因被发现，人们对抑癌基因p53在肿瘤发生中的作用已进行了较为深入的研究。p53基因的突变，失活及缺失与50%的人类肿瘤发生有关。最近，又报告发现两个新的“p53样”抑癌基因-p73与p73L。p73和p73L所克隆的基因编码的蛋白质，无论在结构上，还是在功能上均与p53蛋白相似，本文对此方面的研究进展做一综述。

一、p73：

(一)p73基因的克隆、定位及表达：Kaghad等^［1］在1997年利用对应于胰岛素信号中介体(IRS-1)结合区的简并寡聚苷酸探针筛选COS细胞cDNA文库时，偶然发现一个假阳性克隆，其编码序列为IRS-1结合结构域无任何同源性，而与p53基因的结构具有同源性，将其命名为p73基因，用荧光原位杂交技术发现p73基因定位于1p36.2-1p36.3。p73基因由13个外显子及12个内含子组成。p73基因表达产物p73蛋白在结构上与p53蛋白具同源性。p53蛋白有4个主要的功能单元，即转录激活结构域(N-terminal acidic transactivation domain, TAD)、DNA结合结构域(DNA-binding domain, DBD)、寡聚结构域(C-terminal homooligomerization domain, OD)及羧基端。p73蛋白与p53蛋白在TAD有29%的氨基酸残基相同，在DBD有63%的氨基酸残基相同，在OD有38%的氨基酸残基相同。同时，Kaghad等^［1］从人大肠癌组织cDNA文库中筛选出两种cDNA，分别编码p73 α及p73 β蛋白。后来，De Laurenzi等^［2］和Ueda等^［11］又分离出p73 γ、p73 δ以及p73 ε。它们都是p73基因的转录剪切变异体。以全长形式表达的p73为α，β则是较短的mRNA变异体，其外显子13被剪切掉，而γ则是外显子11被剪切掉。δ的外显子11、12、13均被剪切掉。p73 α蛋白由636个氨基酸组成，p73 β蛋白由494个氨基酸组成。通过RT-PCR方法，在脑、肾、胎盘、结肠、心、肝、脾及骨骼肌均可检测到p73 α及p73 βmRNA，说明p73 α及p73 β蛋白低水平表达的广泛性。而p73 γ及p73 δ在有外周血淋巴细胞、原始的角质细胞以及不同的肿瘤细胞株中检测到，包括：成神经细胞瘤、成胶质细胞瘤、黑色素瘤、肝细胞瘤和白血病。5种p73基因转录剪切变异体在同一种肿瘤的不同株的原始细胞及重建的细胞株中表达形式均不同。De Laurenzi等^［2］双重杂交测定法(two-hybrid assay)检测p73变异体间的同源二聚体及异源二聚体间的相互作用时发现p73 γ及p73 δ均不与p53作用，而p73 γ与所有p73变异体强烈反应。同时，p73δ与p73α和p73γ能有效地结合但与p73β结合则较弱。但Ueda等^［11］对p73 γ和p73 ε测序后发现该两个p73变异体编码的p73蛋白具有远距离羧基端结构，其与p73 α和p73 β变异体不同，但所有p73变异体都能激活一致的p53结合序列上的启动子，仅程度不一而已，故他们认为p73分子的转录激活和调控功能受p73羧基端的选择性剪接影响。Kaghad等^［1］亦指出：虽然p73与p53蛋白在C-末端区域(364～393）没有发现明显的同源性，但人p73 α的C-末端结构域与最近在无脊椎动物中发现的p53类似分子存在同源性，说明p53基因可能是从更原始的“p73样(p73-like)”基因进化而来。酵母双杂交系统研究结果表明，与p53一样，p73分子具有较强的同型相互作用，且p73与p53分子间也存在明显的异型相互作用。上述结果显示p73变异体之间以及与p53之间的反应能力不同水平的调节，具体机制尚待进一步研究证实。

Kaghad等^［1］利用RT-PCR及Northern印迹技术观察p73基因在肿瘤细胞株的转录表达情况时，发现成神经细胞瘤细胞株IMR-32、SK-N-BE(2)、SK-N-MC、SK-N-SH及结肠癌细胞株HT-29的p73mRNA转录水平较高，而成神经细胞瘤细胞株CHP-212、SMS-BC、SMS-KAN及SK-N-AS的p73 mRNA转录水平极低；Western印迹技术显示在蛋白表达水平上，仅IMR-32、SH-N-SH及HT-29细胞株p73蛋白表达水平较高。有趣的是虽然SK-N-BE(2)及SK-N-MC细胞株的p73mRNA转录水平较高，但几乎检测不出p73蛋白的表达，通过对RT-PCR产物进行测序也未能发现在p73基因编码区存在任何突变，因此，Kaghad推测p73基因的表达过程中可能存在后成调节(epigenetic regulation)，如遗传印迹(imprinting)和/或翻译抑制现象。序列分析发现，成神经细胞瘤p73基因在外显子2的第4及14位存在等位多态性(G→A及C→T取代)现象，取代位置恰好在AUG(启动密码子)上游。理论上，这区域可形成茎环结构，在p73基因转录过程中起调控作用。在8株成神经细胞瘤细胞株中，仅IMR-32、CHP-212及SK-N-SH存在A/T等位基因拷贝。尤其值得注意的是SH-N-SH细胞株，其p73基因并不存在杂合性缺失(LOH)，且同时具有G/C及A/T等位基因拷贝，但在转录水平仅发现A/T等位基因拷贝的表达。通过分析健康献血者外周血细胞p73基因的表达情况时，也发现G/C、A/T等位基因拷贝不会同时表达。上述结果表明p73基因的表达是单等位基因的(monoallelic)，这与传统的抑癌基因不同，因传统的抑癌基因需受2次打击后才会失活，而p73基因也许经遗传印迹早已使其中的一个等位基因拷贝沉寂，剩下的另一基因拷贝发生缺失则会导致p73蛋白的缺乏。正如实验结果所示，对于成神经细胞瘤而言，G/C等位基因拷贝也许经遗传印迹早已失活，若A/T基因拷贝发生缺失的话，则无法表达p73蛋白。但Mai等^［3］研究肺癌p73基因的表达情况时，取正常肺组织与肿瘤组织作对照，p73在肿瘤组织中有较高表达，在21例肺肿瘤及配对的正常肺组织间对外显子2的C/T等位多态性作等位基因特异性表达分析(allelic-specific expression analysis)发现5个杂合样本在肿瘤组织中的表达是双等位基因(biallelic)，而在配对的正常肺组织中的表达则是单等位基因。再作单核苷酸引物扩增分析(single-nucleotide primer extension analysis)时也证实了上述结果。

(二)p73蛋白的功能：在结构上，p73蛋白与p53蛋白具有同源性，其功能是否也相似?已知p53蛋白通过激活p21^Waf而抑制细胞分裂，p73是否也具有此功能?Kaghad等^［1］将p73 α cDNA转入SH-N-AS细胞(此细胞不表达p73蛋白)后，在那些成功地表达野生型p73蛋白的细胞中，p21^Waf蛋白的表达水平显著增高；集落形成试验也发现成功地表达野生型p73蛋白的细胞未能形成集落。由此可以认为结合及转录激活一些p53靶基因是p73分子的保守特性，同时也说明p73蛋白通过p53同样的途径抑制细胞生长。根据De Laurenzi等^［2］的研究显示：p73γ在激活p21^Waf启动子的转录作用比p53或p73β显著低，而p73 δ和p73 α的作用则处于p73 β与p73 γ之间。p73变异体在不表达p53的骨肉瘤SAOS-2细胞株中抑制细胞生长的能力与其对p21^Waf启动子的转录激活能力相应。即p73β阻止集落形成的能力最强，而p73 γ最弱。Jost等^［4］将p73基因转入SAOS-2细胞(p53基因位点存在纯合性缺失)，可诱导SAOS-2细胞凋亡，说明p73蛋白至少在过度表达的情况下可诱导细胞调亡。以上均说明p73与p53蛋白具有一些相似的功能。尽管诱导p73蛋白的因素及信号仍不清楚，但肯定有别于诱导p53蛋白表达的因素。Kessis等^［5］和Caelles等^［6］将IMR-32细胞用1 nmol/L的放线菌素D处理24 h,p52和p21^Waf蛋白水平显著提高，而p73蛋白浓度无显著变化。为了评估DNA损害对p73 α水平的进一步影响，将IMR-32细胞暴露于254 nm紫外线中15小时，p53和p21蛋白浓度上升，p73 α蛋白水平却没有变化，表明p73与p53虽然结构相似，并均可激活p21^Waf，但在信号激活途径方面存在明显差异。p73与p53分子在细胞中可能还有着其它不同的功能。此外，是否像c-myc家族一样能形成p53-p73异源二聚体或者与其它“p53样”分子形成异源二聚体而产生新的功能?De Laurenzi等^［2］的研究就显示p73的四种变异体之间可能通过影响异源二聚体的形成来调节p73的转录和生长抑制活动。根据目前的研究发现大多数成神经细胞瘤中的p53蛋白常是野生型的，但未能起到抑癌的作用，故对细胞内p53与p73蛋白或p73变异体之间以及p73与其它“p53样”蛋白之间的相互作用的认识将对研究成神经细胞瘤很有帮助。正如Kaghad等^［1］指出，染色体1p36是成神经细胞瘤和其它肿瘤经常检测到缺失的区域，故认为该区可能还包括更多的未知的抑癌基因。但他们在做成神经细胞瘤株1号染色体短臂和p73杂合性缺失(LOH)的分析时，在p73等位基因的其余区域找不到编码序列的缺失。然而，这就可能证明p73是单等位基因表达的，同时支持p73为神经母细胞瘤的候选基因的观点。由于p53具有