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Transfer of allogenic MHC gene into thymus by retroviral vector induces tolerance
LI Jin-Hua1, TANG Hao2, YU Xue-Qing1, CHEN Yong-Xiong1, ZHANG Shi-Guang1
1 Department of Nephorology,2Emergency Department,the First Affiliated Hospital,
Sun Yat-Sen University of Medical Sciences,Guangzhou (510080)
Abstract AIM: A mice myocardium allograft tolerence model was constructed by intrathymic injection of retroviral vector PXN(N2-B19-H-2Kb)to express allogenice major histocompatibility complex(MHC).MEHTODS: Retroviral vector PXN（N2-B19-H-2Kb）was injected into BALA/C thymus directly to express MHC of C57BL/6(H-2Kb);after 14 days,myocardium of C57BL/6(H-2Kb) mice was transplantated into BALA/C mice;and the polymerase chain reaction (PCR) , the reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and flow cytometry assays detected DNA,mRNA and MHC protein expression in thymocytes.RESULTS: Allogenic MHC gene had been integrated into the chromosomal DNA of BALA/C thymus and expressed stably; It induced mouse heart allograft tolerance, 17days vs 8 days;P＜0.01. CONCLUSION: Allogenic MHC gene transferring into recipient thymus directly could induce allogenice mice tolerance.
MeSH Genes; Transfection; Major histocompatibility complex; Immune tolerance; Heart transplantation
移植排斥反应一直是困扰器官移植的主要问题之一。通过T细胞在胸腺内接触异基因蛋白质抗原而诱导特异性的免疫耐受是目前的研究的热点之一［1］。据此，我们运用基因转移技术，通过胸腺内注射表达外源性主要组织相容性抗原复合物（major histocompatibility complex ,MHC）抗原质粒PXN（N2-B19-H-2Kb） ,以小鼠心肌移植为模型，诱导特异性的免疫耐受，为免疫耐受提供理论和实验依据。
材料和方法
(一)材料:受体鼠BALB/C（H-2d）,供体鼠C57BL/6(H-2b）,第三无关供体鼠CBA/J(H-2k），皆雄性，6～8周龄(本校实验动物部); DOTAP(Boehringer Marmnnheim);DMEM细胞培养基、抗小鼠CD3单克隆抗体(GIBCO-BRL);ConA、丝裂霉素(Sigma);氚标记胸腺嘧啶核苷(［3H］-TdR)3.7×107Bq/mL,比度7.4×1011Bq/mmol(中国原子能科学研究院);生物素标记抗H-2Kb单克隆抗体(Pharmingen);荧光素标记亲和素avidinFITC(SABC);表达供体鼠(H-2b)MHC I类抗原的逆转录病毒载体PNX(N2-B19-H-2Kb)质粒(美国国立卫生研究院Sandra Doren博士惠赠)。
(二)方法:
1.外源性MHC基因胸腺转移：麻醉BALB/C（H-2d）小鼠，仰卧位固定四肢及头部，在胸骨上窝正中切开皮肤，钝性分离至气管并沿气管向前直至暴露胸腺上极，MHC基因转移组每只小鼠注射PNX(N2-B19-H-2Kb)1.2μg加DOTAP 2μg 和DMEM 2 μL，对照组单纯注射DOTAP 2 μg加 DMEM 2μL，缝合皮肤。
2.外源性MHC基因表达的检测：逆转录病毒载体及引物A、B和C见图1。胸腺注射后28 d，（1）按文献［2］提取DNA。以一对引物（引物B: 5'- GCT CTT TCT TTC TGG CTG CT -3'. 引物C: 5'-GCC AGA GAT CAC CTG AAT AGT GTG -3'.检测目的基因在小鼠胸腺细胞的整合。PCR:denaturation 93℃ 1 min, annealing 50 ℃ 1 min,extension 72 ℃ 2 min ,35 cycles,final extension 72 ℃ 5 min，产物409bp；（2）按文献［2］提取总RNA,反转录后以一对引物作PCR,引物A: 5'- TAT ATA GCA CGG CAC TGC CG-3'.C同上，产物 431bp。以一对引物(sense： 5'- CCT GGT CTT T CTG GTG CTT G -3', anti-sense: 5'- GCA TCA TGA TGC TTG ATC AC -3')扩增小鼠β2微球蛋白基因的mRNA作为阳性内参照，反转录后PCR方法同上，产物360bp；（3）取胸腺注射PNX(N2-B19-H-2Kb）的小鼠胸腺细胞，以对照组的小鼠胸腺细胞为零点，用抗H-2Kb单克隆抗体直接免疫荧光法染色，流式细胞仪检测目的基因在转染小鼠胸腺细胞上的表达。
fig 1 The PXN（N2-B19-H-2Kb ）retroviral vector and locations of primer A,B and C
A: Location of the 5' B19 promoter primer for H-2Kb cDNA ,used for mRNA RT- PCR;B: Location of the 5' primer for H-2Kb cDNA ,used for DNA PCR；C: Location of the 3' primer for H-2Kb cDNA ,used for mRNA RT- PCR and DNA PCR
图1逆转录病毒载体PXN（N2-B19-H-2Kb ）结构图及引物A，B和C位置
(三)实验动物分组和小鼠心肌移植模型建立：供体鼠：将40只C57BL/6 小鼠随机分为4组：对照1组和对照2组胸腺注射DOTAP 2 μg加 DMEM 2μL；第3组胸腺注射PNX(N2-B19-H-2Kb) 1.2 μg加DOTAP 2 μg 和DMEM 2μL；第4组静脉注射PNX(N2-B19-H-2Kb)1.2 μg加DOTAP 2 μg 和DMEM 2 μL；第5组为第三供体组(CBA/6小鼠,10只)。受体鼠：皆BALB/C小鼠，50只随机分为5组。胸腺注射或静脉注射的当天及第3 d，除对照1组外，各组小鼠给予腹腔注射anti-CD3 monoclonal Ab 8.4 μg/mice，14 d后按文献［3］行小鼠心脏移植。术后第5 d用上海医用电子仪器厂68722型心电图机检测移植心肌心电活动，无心电者视为手术失败。以心电消失日为移植心肌存活的终止时间。
(四)小鼠脾细胞对丝裂原增殖反应的观察［4］:各组小鼠胸腺注射或静脉注射后第5周分离脾细胞，96孔板每孔加5×105细胞,设3个复孔,加入5.0μg/mL(终浓度)ConA.用［3H］-TdR掺入法作脾细胞对丝裂原ConA的增值反应。常规收集细胞,测样本［3H］-TdR掺入率,以counts·min-1表示。
(五)小鼠混合淋巴细胞反应［5］：用［3H］-TdR掺入法分别作对供体和第三供体的单向混合淋巴细胞反应（mixed lymphocytes reaction,MLR）:各组小鼠胸腺注射或静脉注射后第五周分离脾细胞，调细胞浓度为5×106/mL,作为MLR中的反应细胞,按5×105/孔加入96孔板, 设3复孔;另取丝裂霉素处理的C57BL/6或CBA/6小鼠脾细胞作为刺激细胞(5×105/孔).混合培养56 h后,加入用［3H］-TdR(1.85×107Bq/孔).继续培养10h,常规收集细胞,测样本［3?H］-TdR掺入率,以counts·min-1表示。
(六)统计处理: 实验数据以x±s表示。用多因素方差分析（ANOVA），继以最小显著差异法（LSD法）比较组间差异。
结果
(一)外源性MHC基因表达的检测：转染PNX(N2-B19-H-2Kb)载体的小鼠28 d后分别提取胸腺细胞DNA和RNA，作PCR和RT-PCR。扩增产物在1.5%琼脂糖电泳分别分析显示有特异性的H-2Kb cDNA 扩增片段(409bp，见图2)和H-2Kb mRNA反转录后cDNA扩增片段(431 bp, 见图3)，而注射DOTAP+DMEM的胸腺细胞则没有。RT-PCR内参照片段为360bp。
