摘要目的：研究红景天甙(salidroside, Sal)对缺氧( 2%～3%)状态下兔肺动脉平滑肌细胞(PASMC)增殖、DNA合成、细胞周期和c-fos,c-myc 原癌基 因表达的影响。方法：应用细胞培养、四唑盐比色试验(MTT)、［³H］ -胸腺嘧啶核苷(［³H］-TdR)掺入、细胞周期测定和斑点杂交的方法。结果：发现缺氧24 h可直接刺激PASMC，使MTT之OD值增加95%(P＜0.05)，［³H］-T dR的掺入量增加140%(P＜0.01)；在缺氧的PASMC培养液中加入Sal(1200 μg/mL)可抑 制缺氧的这种促增殖作用，PASMC的MTT之OD值与［³H］-TdR掺入量与缺氧组相比显著 下降(P＜0.05)；流式细胞分析显示缺氧24 h PASMC G₂/M期细胞比例比常氧组明显 增 多(P＜0.01),G₀/G₁期细胞比例明显减少(P＜0.05)，与缺氧组相比Sal可增 多PASMC G₀／G₁期细胞比例，减少G₂／M期细胞比例(P＜0.05)；缺氧可促 进c-fos,c-myc原癌基因表达，该效应可被Sal所抑制。结论：红 景天甙可抑 制缺氧所致的PASMC增殖、DNA合成、进入G₂/M期的细胞比例和c-fos,c-myc原癌 基因表达。

Effects of salidroside on the proliferation and c-fos, c-myc oncogene expression of

rabbit pulmonary artery smooth muscle cell s under hypoxia

ZHAO He-Ling, LIN Shu-Xin, JIA Bin, ZHANG Li-Li, ZHANG Shi-Fan

Department of Pathophysiology, Fourth Military Medical University, Xian(710032)

Lanzhou General Hospital

Abstract AIM：To investigate the effects of salidroside on the proliferation, DNA synthesis, cell cycle and c-fos, c-myc oncogene expre ssion of rabbit PASMC(pulmonary artery smooth muscle cell) under hypoxia.METHODS ：Techniques of cell culture, M TT test, ［³H］-TdR incorporation, flowcytometric DNA analysis and Dot blot wer e used.RESULTS： OD value of MTT and ［³H］-TdR i ncorporation to PASMC increased significantly by 95% (P＜0.05) and 140%( P＜0.01) respectively after 24 h hypoxia, and salidroside(1 200 μg/mL) could inhibit these effects induced by hypoxia(P＜0.05); Flowcytometric DNA ana lysis revealed that hypoxia induced significant enhancement of G₂/M phase of PASMC (P＜0.01) and decreased G₀／G₁ phase of PASMC(P＜0.05); While salidroside could reverse these effects (P＜0.05); hypoxia stimulate d c-fos, c-myc oncogene expression of PASMC, and the effect could be inh ibited by salidroside.CONCLUSION：Salid roside inhibited the proliferation, the cell proportion of G₂／M phase, DN A synthesis and c-fos, c-myc oncogene expression of PASMC induced by hy poxia.

MeSHAnoxia; Muscle, smooth; Pulmonary artery; Genes, fos; Ge nes, myc; Oncogenes

缺氧性肺动脉高压形成的主要因素有缺氧性肺动脉血管收缩和缺氧性 肺动脉壁构型重建(remodeling)，而肺动脉平滑肌细胞的增殖是缺氧性肺动脉壁构型重建的 一个重要环节^［1］。影响PASMC增殖的因素很多，如缺氧、血管紧张素-Ⅱ、内皮素 、张力^［2］等。药用植物红景天具有抗缺氧、提高机体对高原的适应能力 等 作用，在我国西北、西南高原缺氧地区被用于防治高原适应不全症^［3］，并取得满 意效果，但对其作用机理尚缺乏研究。本试验应用细胞培养、四唑盐比色试验、［³H］ -TdR掺入、流式细胞仪和斑点杂交等方法研究缺氧状态下SAL对兔PASMC增殖、DNA合成、细 胞周期和c-fos,c-myc原癌基因表达的影响，探讨其在防治缺氧造成的肺动脉壁结 构改变和肺动脉高压中的可能作用机制。

材料与方法

(一)实验动物：纯种新西兰幼兔(出生1个月，体重400～600 g)，由本校动物实验中心提供 。

(二)主要试剂和药品：RPMI-1640培养基购自GIBCO公司；小牛血清购自杭州四季青生物工程 材料研究所，批号9610003； 胰蛋白酶、MTT(噻唑蓝)购自Sigma公司；［³H］-TdR购自 上海原子能科学研究院，比度7.4×10¹¹Bq/mmol、放射性浓度3.7×10⁷ Bq/m L；c-fos,c-myc原癌基因探针购自华美生物试剂公司；红景天甙由兰州军区总医院 提 供，根据Saratikov法提取；PPO购自FLUKA公司；POPOP、DMSO为上海化学试剂一厂产品。

(三)实验方法：

1.PASMC的培养和细胞同步化方法：新西兰幼兔麻醉后，无菌取出肺主动脉，用贴片法进行 PASMC的原代培养。采用细胞分裂相脱离同步化法，使细胞进入同步化生长^［4］。

2.PASMC的缺氧培养：已同步化的PASMC接种于96孔板24 h后，换成含5%小牛血清RPMI-1640 培养液，进行缺氧及常氧对照实验。缺氧装置为自制有机玻璃小室，以20 mL/min连续通入5 % CO₂＋95％N₂的混合气体，测得小室内氧气浓度维持在2～3%(CR-2测氧仪监测 )，小室置于37℃培养箱内。常氧对照组的细胞置于5% CO₂孵箱内。

3.四唑盐比色(MTT)试验：用0.25%胰蛋白酶消化细胞，用含10%小牛血清的RPMI-1640配制 成 5×10⁴细胞/ml的细胞悬液，移入96孔板，细胞数为5×10^3．100 μL^-1/孔， 将培养板移入CO ₂孵箱中，在37℃、5% CO₂及饱和湿度条件下，培养24 h，移去旧培养液，换5%胎牛 血清的RPMI-1640，并加入Sal，在含2%～3% O₂缺氧小室继续孵育20 h后，每孔加入MTT 溶液(5 mg/mL) 20 μL，继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内上清液，每孔加入DMSO 150μL，振荡10 min，选择490 nm波长在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值(OD值)。

4.［³H］-TdR掺入实验：将消化好的细胞悬液移入96孔板，使细胞数为5×10^3．100 μL^-1/孔，培养24 h后，换为5%小牛血清的RPMI-1640培养液，同时加入Sal， 在含2%～3％ CO₂缺氧小室继续培养18 h，然后加入［³H］-TdR(3.7×10⁴ Bq/mL)，再继 续孵育6 h后，中止反应，收集细胞于9999型玻璃纤维滤纸上，用液闪计数器测定［³H ］-TdR掺入量。

5.流式细胞仪(FCM)测定细胞周期：长成单层的PASMC换含5%小牛血清RPMI-1640培养液，分 常氧(21%)，缺氧(2%～3％），缺氧(2%～3％）+Sal组，培养24 h后，用0.25%胰酶-EDTA 消化离心收集细胞，0.01 mol/L pH 7.4 PBS洗2次，1 000 r/min 离心10 min，上机前加 含RNA 酶的PI染液4 ℃ 30 min，调细胞浓度至10⁶/mL，用FCM EPICS Profile Ⅱ型测定细胞周 期。

6.c-fos,c-myc原癌基因斑点杂交：制备1×10⁶细胞/mL悬液，每组加入10 mL 悬液，培 养24 h以后，换为含5%小牛血清RPMI-1640培养基，分别作常氧及缺氧培养，24 h后加Sal， 分别 于30 min，1 h中止反应并收集细胞，按文献^［5］方法提取总RNA，以260 nm波长紫 外光吸光度测定RNA含量，c-fos基因探针长1.6 kb，c-myc基因探针长1.3 kb， 通过缺口 平移法进行放射性标记，每一样品点两个斑点，用量分别为5 μg,2.5 μg RNA，然后按文 献^［6］方法进行RNA斑点杂交，最后进行放射自显影。

7.统计分析：所有数据均以平均数±标准差(±s)表示，以组间t检验判 断差异显著性。细胞周期采用总体率假设检验。

结果

1.Sal对缺氧状态下PASMC增殖和DNA合成的影响：结果如图1所示，结果表明，Sal可抑制缺 氧所致的PASMC增殖和DNA合成。以单纯缺氧组为对照，Sal使PASMC的OD值下降23%，［³ H］-TdR掺入量 下降28%(P＜0.05)。PASMC的OD值下降45%，³H-TdR掺 入量下降28%(P＜0.05)。

Fig 1 Effects of salidroside on the proliferation and DNA synthesis o f PASMC under hypoxia●P＜0.05,vs H group; P＜0.01, vs N group(±s,n=12)

N=normoxia; H=hypoxia; H+Sal=hypoxia+salidroside

图1红景天甙对缺氧状态下PASMC增殖和DNA合成的影响

2.红景天甙对缺氧状态下PASMC细胞周期的影响：流式细胞分析表 明，与常氧对照 组相比，PASMC缺氧培养24 h后，显著增加进入G₂/M期的细胞比例，显著减少进入G₀ ／G₁期的细胞比例(P＜0.01)，Sal能减少缺氧的PASMC进入G₂／M<