摘要目的和方法：为了探讨巨核细胞增殖调控，我们 研究了肝素对重组人血小板生成素(recombinant human thrombopoietin, rhTpo)刺激BALB/ c小鼠巨核系祖细胞(CFU-MK)和人巨核细胞系-红白细胞白血病(human erythroleukemia, HE L)细胞株增殖的作用。采用半固体和液体培养、CFU-MK-乙酰胆碱脂酶染色和5-溴-2′-脱氧 尿嘧啶核苷(5-BrdU)-酶联免疫吸附等方法，观察了CFU-MK和HEL细胞集落数以及HEL细胞的 吸光度。结果：在培养基中加入rhTpo 100 ng/mL和肝素2.5 U/mL,细胞集落和吸光 度高于不加肝素对照组。CFU-MK被扩增150%，HEL细胞集落和HEL细胞吸光度增幅分别为102% 和106%。结论：肝素能增强血小板生成素对巨核细胞增殖的作用。

Heparin enhances the effect of thrombopietin on proliferation of megakaryocytes

LI Wen-Lin,SHI Xiao-Yu,ZHOU Ying,XIONG Li-Xia,GUAN Hua-Feng

Department of Pathophysiology, Department of Histology and Embryology , Jiangxi Medical College, Nanchang(330006)

Abstract AIM and METHOD：In order to investigate the regulatio n of megakaryocyte proliferation, action of heparin on stimulating the proliferat ion of BALB/c mice CFU-MK and human megakaryocytic lineage-HEL cells by thrombop oietin (Tpo) were studied. Semi-solid and liquid cultures, CFU-MK acetylcholines terase staining and 5-bromo-2'-deoxy-uridine (5-BrdU)-elisa were used. CFU-MK, H EL colonies and absorbance were observed.RESULTS: In the medium tre ated with rh Tpo 100 μg/L and heparin 2.5×10³ U/L, the colonies and the absorbance incre ased as compared with control group without heparin. A combination of rhTpo 100 μg/L with heparin 2.5×10³ U/L increased CFU-MK by 150%, HEL colonies by 102 % and HEL absorbance by 106%, respectively.CONCLUSION: Heparin enha nces the effect of Tpo on the proliferation of megakaryocytes.

MeSHHeparin;Thrombopoietin;Megakaryocyte;Mice

血小板生成素(thrombopoietin, Tpo)是近年来分离纯化出来的细胞因 子，能刺激血小板前体细胞-巨核细胞的生长和成熟，是巨核细胞生长发育的正调节因子 ［1］。肝素有抗凝血作用，在临床上主要用于血栓栓塞性疾病以及弥散性血管内凝血 症。近年来，有研究表明，肝素有加强成纤维生长因子的作用^［2］，中和血小板因 子4对人巨核细胞系-红白细胞白血病(human erythroleukemia, HEL)细胞株的抑制作用 ^［3］。为了探讨巨核细胞增殖调控，本文研究了肝素对重组人血小板生成素(reocombin ant human thrombopoietin, rhTpo)刺激小鼠骨髓巨核系祖细胞(CFU-MK)和人巨核细胞系-H EL细胞株增殖的作用。

材料与方法

(一)试剂：rhTpo(Amgen, USA)，-20℃保存备用，临用前稀释，实验浓度为4 μg/L, 20 μg/L,100 μg/L。肝素(Sigma)4℃保存备用，临用前稀释，实验浓度为2.5×10³ U/L， 培养基凝固后再 加入肝素。

(二)细胞来源：取7周龄BALB/c小鼠股骨骨髓单个核细胞。本院形态中心实验室提供HEL细胞 株。

(三)细胞集落培养及乙酰胆碱脂酶染色：

1.小鼠骨髓单个核细胞：2×α-培养液中含有10% 2-巯基乙醇(10^-4 mol/L)，0. 5%饱和转铁蛋白，3%牛血清白蛋白，12.5%小牛血清，20%琼脂。细胞入35 mm直径培养皿， 细胞浓度为1.8×10⁵／皿，每个培养皿1 mL上述培养基。37℃，5% CO₂，培养10d 。C FU-MK乙酰胆碱脂酶特异性染色^［2］，滤纸吸干培养皿中的培养基，1%多聚甲醛固 定，PBS洗，乙酰胆碱脂酶染色(染色液组成：乙酰硫酸胆碱50 mg,0.1 mol/L,pH 6.0磷酸 缓 冲液75 mL，0.01 mol/L硫酸铜10 mL,5 mmol/L铁酸氰钾10 mL)。CFU-MK呈黄棕色，计数集 落，≥3细胞为一个巨核细胞集落^［4］。

2.HEL细胞：HEL细胞(1×10³／孔)入24孔培养板，每孔0.25 mL α-培养液，10%牛 血 浆，10% 2-巯基乙醇(10^-4 mol/L)，10％小牛血清，10%氯化钠(0.3 mg/mL)，37 ℃，5% CO₂条件下培养4 d。滤纸吸干培养液，2%多聚甲醛固定，Harris苏木精染色。集 落计数，≥20细胞为一个集落^［3］。

(四)5-BrdU-酶联免疫吸附试验：α-培养液中含10%小牛血清，0.15 mg/mL-谷氨酸，HEL细 胞(4×10³／孔)入96孔培养板，每孔100μL上述培养液。37℃，5%CO₂培养3 d。每 孔10μL 5-溴-2′-脱氧尿嘧啶核苷(5-BrdU)掺入HEL细胞DNA中，37℃，孵育3 h。除去多 余的5-BrdU,-20℃预冷盐酸酒精固定细胞30 min,-20℃，核酸酶(Boehringer Mannhein)消 化DNA，30 min，37℃。加入5-BrdU单克隆抗体-过氧化物酶(Boehringer Mannhein),孵育细 胞30 min，37℃，加入底物ABTS。酶标仪测吸光度，波长405 nm。

(五)统计处理：结果用±s表示，组间差异显著性用t检验判断。

结果

一、肝素增强Tpo对巨核系祖细胞增殖的作用：

在10 d的半固体培养中，rhTpo 100 μg/L+肝素2.5×10³ U/L组对小鼠骨髓巨核系祖细 胞有明 显扩增作用(图1)，与不使用肝素的rhTpo 100 μg/L组比较，CFU-MK扩增2.50倍，不加肝 素 使CFU-MK产率下降60%。rhTpo 4 μg/L+肝素2.5×10³ U/L和rhTpo 20 μg/L+肝素2.5 ×10³ U/L组，CFU-MK增加不显著，经统计学处理，差别无显著。

Fig 1Heparin enhances effect of Tpo on growth of murine CFU-MKP＜0.01, vs control group of no heparin

图1肝素增强Tpo对小鼠CFU-MK生长的作用

二、肝素增强Tpo对HEL细胞增殖的作用：

在4 d的半固体培养中，肝素增强了rhTpo对人巨核细胞系-HEL细胞集落扩增的作用(图2)。r hTpo 100 μg/L+和肝素2.5×10³ U/L组对HEL细胞集落形成的刺激作用强于rhTpo 100 μg/L组，HEL细胞集落扩增2.02倍，不加肝素的rhTpo 100 μg/L组，HEL细胞集落产率下 降50%。rhTpo 4 μg/L+肝素2.5×10³ U/L组以及rhTpo 20 μg/L+肝素2.5×10³ U/L的HEL，细胞集落与相应的对照组比较，集落数无显著增加。

Fig 2Heparin enhances effect of Tpo on growth of HEL colonies. P＜0.01,vs control group of no heparin

图2肝素增强Tpo对HEL细胞集落生长的作用

在液体培养系中加入5-BrdU,取代HEL细胞在DNA复制时所需的胸腺嘧啶核苷，作为DNA复 制标志物。结果显示rhTpo 100 μg/L+肝素2.5×10³ U/L组吸光度最高(图3)，表明DN A复制最快，掺入的5-BrdU最多。其它组吸光度无显著增加。

Fig 3Heparin enhances effect o f Tpo on DNA synthesis of HEL cells ?P＜0.01, vs control group of no heparin

图3肝素增强Tpo对HEL细胞DNA合成的作用

讨论

人Tpo的cDNA由1774个核苷酸构成，基因的编码区全长为6kb^［5］，人Tpo由35 3个氨基酸组成，全长Tpo蛋白质38 kD^［6］。其C-端是富含糖基化位点的结构域 ［7］，推测Tpo在这个区域进行糖基化。肝素作为一种抗凝血药物已在临床长期 使用 ，肝素增强Tpo对巨核细胞增殖的作用尚未见报道，本文首次报道初步研究结果。我们利用 肝素这一粘多糖物质通过与Tpo的C-端富含糖基化位点结合，使Tpo糖基化，也即形成肝素结 合蛋白(heparin-binding protein)。糖基化的Tpo如同糖基化的Epo^［8］一样，其 半衰期延长，另一方面，肝素抗凝血作用也因与Tpo结合而使肝素失去抗凝血作用，这样 用肝素增强Tpo的作用时，可以不必顾虑肝素发挥其抗凝血作用。

Zeigler^［9］等的研究表明，Tpo促进小鼠骨髓巨核系祖细胞生长。石小玉 ^{［ 10］}等的研究表明，Tpo对HEL细胞增殖有刺激作用。据此，我们选择小鼠骨髓巨核系祖 细 胞和HEL细胞为实验对象。同时也考虑选择不同来源细胞，一是来自骨髓，一是来自细胞株 ，这将使实验结果更可靠。将Tpo+肝素作用于小鼠骨髓巨核系祖细胞和人巨核细胞系-HEL细 胞株，在体外半固体和液体培养体系中，<