摘要目的：研究兔心局部缺血“预处理”后，局部缺血和相邻非缺血心肌热休克蛋白70(HSP₇₀) mRNA的水平变化。方法：提取心肌组织总RNA，用HSP₇₀探针进行斑点杂交。结果：缺血预处理组的缺血区和非缺血区HSP₇₀ mRNA表达水平均显著高于对照组相应部位(P＜0.05)，而每组内的缺血区及非缺血区间无显著差异(P＞0.05)。结论：局部缺血“预处理”后，缺血和非缺血区两处心肌的内反应呈“一致性”；缺血预处理对心肌的保护作用可能与HSP₇₀的合成增多有关。

Transcription of hSP₇₀ gene induced by regional ischemic preconditioning in remote virgin myocardium of rabbits

WEN Chao-Yang, ZHANG zhi-Shou, HAO Hao-Jie, LI Ru-HanPLA General Hospital, Beijing (100853)

Abstract aIM: To define whether regional ischemic preconditioning also increases hSP₇₀ mRNA level in remote virgin myocardium.METHODS：13 rabbits were randomly assigned to either a 'preconditioned' group (n=6) which underwent 4 episodes of 5-min occlusion and reperfusion followed by 60-min reperfusion or a sham -operated control group (n=6). Then 24 tissue samples from the myocardium perfused by LAD, immediately below the snares, and the remote virgin myocardium were frozon rapidly. HSP₇₀ mRNA was measured by Dot blotting.RESULTS：Four cycles of 5-min ischemia and reperfusion resulted in significant increase(P＜0.05) of HSP₇₀ mRNA in both ischemic and nonischemic myocytes compared with the controls, but HSP₇₀ mRNA levels from both positions of the hearts were similar in every group.CONCLUSION：The heart might be activated as a whole' in some way after regional ischemic preconditioning(PC), and the protection effect of PC might be related to the increased synthesis of HSP₇₀.

MeSHIschemia; heat-shock proteins; Gene; Immunoblotting

缺血预处理(ischemic preconditioning, PC)现象的发现^［1］，展示了心肌保护的新途径。其机制尚未完全阐明。已知局部缺血后缺血心肌HSP₇₀ mRNA表达增加^［2，3］，但另一支血管灌注区的非缺血心肌HSP₇₀ mRNA表达是否增加尚不十分清楚。本实验旨在研究兔心局部缺血“预处理”后，局部缺血区和另一支血管灌注的非缺血区HSP₇₀ mRNA表达水平的变化，从一个侧面探讨缺血预处理保护心肌的机制。

材料与方法

一、主要试剂与仪器设备：

1.HSP₇₀基因片段：北京华美生物工程公司产品，来源：Wistar大鼠cDNA，基因片段长度2.3 kb。2.β-actin基因片段：北京天象人生物工程公司产品，来源：大鼠cDNA，定位：7 pter-922,基因片段长度1.0 kb。3.［α-³²P］dCTP:北京市亚辉生物医学工程公司产品，比活度11100×10¹⁰Bq/nmol，［放射性］活度37×10⁴ Bq/μL，放射化学纯度95%。

二、实验步骤：

(一)心肌标本采取：12只健康新西兰白免，体重1.75～2.3 kg，雌雄兼用。随机分为缺血预处理组(6只)：3%戊巴比妥钠(30 mg/kg,iv)麻醉，监护Ⅱ导心电图，气管插管。开胸，勿损伤胸膜。用眼科园针于冠脉前降支(LAD)近起始部8～10 mm、回旋支第一大边缘支——左室支(MA)的左心耳下缘至心尖部的中点处各穿一根阻闭、松开用的丝线。前降支阻闭5 min、再灌注5 min，如此阻闭/再灌注共4次，随后再灌注1 h；假手术对照组(6只)：即同样开胸、冠脉穿线，但不作阻闭冠脉操作，手术完成后旷置100 min。杀兔取心，从前降支、左室支结扎线远端青紫处各取心肌200～300 mg，共24个标本，迅速液氮保存。

(二)杂交^［4］：采用(异硫氰酸胍-酚-氯仿)一步法提取心肌总RNA。甲醛变性胶电脉法电泳RNA(各孔分别加心肌总RNA30μg，在加有EB的变性电泳胶中3 V/cm电泳40 min)，用于进行Northern印迹。同时每份标本分别等量点样于两张尼龙膜，行斑点印迹，分别与HSP₇₀、β-actin探针杂交。用随机引物法标记DNA探针。用QTM970自动图像分析仪，探测斑点杂交放射性自显影胶片上杂交斑点的积分光密度(IOD)，以HSP₇₀探针杂交斑点的积分光密度(IOD_h)与β-actin探针杂交斑点的积分密度(IOD_β)的比值(IOD_h/IOD_β)，表示标本HSP₇₀mRNA量。

三、统计分析：

数据以表示，全部数据输入计算机数据库，用SAS软件进行分析，采用秩和检验(Wilcoxon2-sample test)。

结果

1.心肌总RNA的变性电泳和Northern杂交分析鉴定：心肌总RNA的变性电泳，呈28 s和18 s两条带(5 s rRNA显示不清楚)，各种分子量的mRNA分布于各带之间。用HSP₇₀探针Northern杂交，呈现杂交带。

2.局部缺血“预处理”后，不同部位HSP₇₀mRNA的表达水平：斑点杂交时，RNA点样量为10μg。局部缺血“预处理”后，局部缺血区和另一支血管灌注的非缺血区HSP₇₀ mRNA表达水平均明显高于对照组相应部位(2.248±2.279, vs0.780±0.686及1.588±2.967 vs 0.539±0.415)(P＜0.05)，每组的前降支与左室支血管分布区心肌HSP₇₀mRNA表达量均无显著差异(P＞0.05)，见图1、2。

pig 1 Dot blot analysis of HSP₇₀,β-actin mRNA from myocardium perfused by LAD

图1前降支分布区心肌HSP₇₀,β-actin mRNA斑点杂交

Pig 2 Dot blot analysis of HSP₇₀,β-actin mRNA from myocardium perfused by MA

图2左室支分布区心肌HSP₇₀,β-actin mRNA斑点杂交

讨论

自Murry等^［1］报道缺血预处理现象以来，大量研究证实这种现象存在于多种动物和人。80年代人们又发现HSP₇₀能保护缺血心肌^［5，6］。当生物细胞处于不同的应激状态(包括温度升高、缺血、缺氧等)时，可导致一组相关蛋白合成的增加，被称为HSPs，其中HSP₇₀在大多数生物中含量最多、最具重要性。

1988年Currie等^［5］首次报道了热处理能保护缺血心肌的现象，同时有HSP₇₀的增多。热处理亦能缩小心梗范围^［7］。Mestril等^［6］以培养的胚胎鼠心肌细胞进行实验：热处理后对持续低氧的耐受性增加，而且用人的HSP₇₀基因片段转染的细胞与对照组相比，对持续低氧的耐受性亦明显增加。这些结果表明HSP₇₀可增加心肌细胞对缺血的耐受性，保护缺血心肌、缩小心梗范围。

我们既往研究显示兔心前降支局部缺血“预处理”能缩小远处左室支持续缺血所致心梗范围，如果缺血预处理保护缺血心肌的作用系HSP₇₀合成所至，那么局部缺血“预处理”后，局部和远处心肌HSP₇₀mRNA均应增加。Knowlton等^［2］和Das等^［3］也曾报道，局部多次短暂缺血发作后1 h局部缺血心肌HSP₇₀mRNA水平增加，并持续24 h以上；远处非缺血心肌HSP₇₀mRNA表达亦增加，但其样本数少(4个)，且缺少内参照校正加样误差，需待进一步验证。

本实验以β-actin为内标校正加样误差，并增大样本数。前降支多次短暂缺血发作后1 h，前降支和左室支分布区心肌的HSP₇₀mRNA的表达均明显高于对照组相应部位(P＜0.05)；而每组内两血管分布区心肌HSP₇₀mRNA表达无显著差异(P＞0.05)。这说明前降支局部多次短暂缺血发作后，兔心前降支和左室支血管分布区心肌内存在反应的“一致性”，提示HSP₇₀合成与缺血预处理现象有关。

参考文献

1Murry CE, Jennings RB, Reimer KA. Preconditioning with ischemia:a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium. Circulation, 1986, 74:1124.

2Knowlton AA, Brecher P, Apstein CS. Rapid expression of heat shock pretein in the rabbit after brief cardiac ischemia. J Clin Invest,1991, 87:139.