摘要目的和方法：采用分离的Sprague-Dawley 大鼠心室肌细胞，以Fura-2/AM荧光指示剂负载，检测心肌细胞内游离钙浓度（［Ca²⁺］_i）变化，探讨内皮素-1（ET-1）对［Ca²⁺］_i的作用及其机制。结果：ET-1（1×10^-7mol/L）引起［Ca²⁺］_i升高分两个时相：快速相和持续相，可被ET_A的特异性受体阻断剂BQ₁₂₃（2×10^-6mol/L）所阻断。移去细胞外液钙以及用百日咳毒素（200ng/mL）处理10h后，ET-1仍引起快速相，但持续相消失。Ryanodine(4μmol/L)和异搏定（2×10^-5mol/L）对ET-1诱导［Ca²⁺］_i升高的作用无显著影响。结论：ET-1升高［Ca²⁺］_i是通过ET_A受体介导；快速相［Ca²⁺］_i升高主要由胞内Ryanodine不敏感的钙池释放造成，与百日咳毒素敏感的G蛋白无关；持续相［Ca²⁺］_i升高主要由胞外Ca²⁺内流引起，不是通过电压依赖性L-型钙通道介导，与百日咳毒素敏感的G蛋白有关。

The effect of ET-1 on ［Ca²⁺］_i and its mechanism in isolated adult rat ventricular myocytes

YAO Ping^*, PAN Jing-Yun, ZHAN Cheng-Yang

* Department of Physiology, Medical College, Jinan University, Guangzhou(510632)

Department of Physiology, Sun Yat-Sen University of Medical Sciences, Guangzhou

Abstract AIM and METHOD: The mechanism of endothelin-1(ET-1)-induced increase of intracellular concentration of free calcium (［Ca²⁺］_i) in isolated adult rat ventricular myocytes was investigated by using Fura-2/AM as a calcium indicator.RESULTS: ET-1(1×10^-7mol/L) induced the biphasic ［Ca²⁺］_i responses including the rapid initial transient phase and the sustained phase. BQ₁₂₃(2×10^-6mol/L) completely blocked ET-1-induced increase of ［Ca²⁺］_i. Pertussis toxin (PTX) (200ng/mL) and removal of extracellular Ca²⁺ didn't inhibit the rapid initial transient phase of ET-1-induced rise in ［Ca²⁺］_i, but abolished the sustained phase of ［Ca²⁺］_i response to ET-1. The biphasic ［Ca²⁺］_i responses to ET-1 were not significantly affected by the additions of Ryanodine (4μmol/L) and verapamil (2×10^-5mol/L) respectively.CONCLUSIONS:ET-1-induced biphasic ［Ca²⁺］_i responses were mediated by ET_A receptor. The rapid initial transient phase was the result of mobilization of ［Ca²⁺］_i from a Ryanodine-insensitive intracellular pool via PTX-insensitive G-protein, the sustained phase resulted from the transmembrane Ca²⁺ influx via a pathway that was not voltage-dependent L-type Ca²⁺ channels, but involved in PTX-sensitive G-protein.

MeSH Myocardium; Endothelins; Calcium; Calcium channels; Proteins

内皮素（endothelin, ET）是由21个氨基酸残基构成的多肽，有ET-1、ET-2和ET-3 3种异构肽。现已证实心肌细胞含有ET-1及其受体^［1,2］，ET-1对心脏组织有直接作用^［3］，包括正性变力、变时作用和延长动作电位持续时间。在较高浓度时，ET-1引起细胞内Ca²⁺动员，并促进Ca²⁺跨膜内流。但ET-1引起成年鼠离体心室肌细胞［Ca²⁺］_i升高的机制尚未完全清楚。本实验采用Fura-2/AM荧光技术，测定成年鼠离体心室肌细胞内游离Ca²⁺浓度，探讨ET-1诱导［Ca²⁺］_i升高的机制。

材料和方法

一、 材料：

(一)动物：Sprague-Dawley大鼠，雌雄不拘，体重150～180g，由中山医科大学实验动物中心提供。

(二)主要试剂和仪器：1型胶原酶（collagenase type 1）、Joklik培养液、Fura-2/AM 、内皮素-1 （endothelin-1）、EGTA ［ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N'-tetra-acetic acid］、Ryanodine和百日咳毒素（pertussis toxin）均为美国Sigma公司产品；BQ₁₂₃为美国Belmont Inc产品；异搏定（Verapamil）为德国Knell产品；Triton X-100为日本Macalai Tesque INC Kyoto产品；850-荧光分光光度计为日本Hitachi制造。

二、 方法：

(一)心室肌细胞的分离：用戊巴比妥钠（50 mg/kg ip）对SD大鼠进行麻醉，开胸取出心脏，立即用改良的Langendorff灌流装置，通过主动脉插管逆行循环灌流心脏。体积分数为95%O₂+5% CO₂混合气体饱和含钙K-H液，其成分（mmol/L）：118NaCl, 25NaHCO₃, 4.7KCl, 1.2KH₂PO₄, 1.25CaCl₂, 1.2MgSO₄, 10葡萄糖。用上述灌流液灌流5min后，改用无钙K-H液灌流。5min后在灌流液中加入1型胶原酶（125U/mL）和牛血清白蛋白（1mg/mL），用此消化液继续灌流20min。此后，每隔5 min以递增方式加入CaCl₂，使灌流液中CaCl₂浓度在20min内增加至1.25mmol/L。灌流温度为37℃，pH约7.4。总灌流时间为45～50min。灌流后，迅速剪下心室肌，在含钙的消化液中把心肌剪成碎片，用吸管反复吹散，分离心肌细胞。离心沉淀，弃去上清液。用新配制的Joklik培养液稀释细胞，使其细胞浓度为5×10⁴/mL。在显微镜下可见80%以上心肌细胞呈典型杆状，横纹清晰。

(二)细胞内游离钙浓度（［Ca²⁺］_i）的测定：将心肌细胞混悬液置于细胞培养瓶内，加入Fura-2/AM（终浓度为1μmol/L），在37℃恒温水浴振荡器中负载45min，使Fura-2/AM进入细胞并充分反应。然后离心沉淀细胞，弃去含Fura-2/AM上清液，用含钙K-H液反复冲洗，离心2～3次。最后将心肌细胞置于含钙K-H液中待用。

实验时，取心肌细胞悬液1mL置于石英杯内，用磁力搅拌器搅拌，维持心肌细胞的悬浮状态。荧光分光光度计的测试参数如下：激发波长340nm，裂隙宽度3nm，发射波长500nm，裂隙宽度10 nm。［Ca²⁺］_i浓度按下列公式^［4］计算：

［Ca²⁺］_i =KD［(F-Fmin)/(Fmax-F)］(nmol/L)

KD为解离平衡常数(224nmol/L)，F为测得的荧光强度，Fmax为加入1%Triton X-100后，测得的最大荧光强度，Fmin为加入EGTA（10mmol/L）后，测得的最小荧光强度。

实验数据以均数±标准差（±s）表示，并用t检验判断均数差异的显著性。

结果

一、 ET-1对心肌细胞［Ca²⁺］_i的影响：

每次取心室肌细胞混悬液标本1mL（以下各实验均相同），加入1×10^-7mol/L ET-1, 引起［Ca²⁺］_i升高呈双相反应，即快速相（R）和持续相（S）。快速相由加入ET-1前对照值的(107.9±8.3)nmol/L升高到(206.5±10.2)nmol/L(P＜0.01)；紧接快速相之后的持续相为(121.2±5.8) nmol/L(P＜0.01)（图1）。

二、 BQ₁₂₃对ET-1诱导［Ca²⁺］_i升高的影响：

BQ₁₂₃是ET_A受体特异性拮抗剂。对照值［Ca²⁺］_i为(108.1±9.6)nmol/L，加入2×10^-6mol/L BQ₁₂₃后，［Ca²⁺］_i为(107.5±8.3)nmol/L (P＞0.05); 5min后再加入1 ×10^-7mol/L ET-1，［Ca²⁺］_i为(108.9±7.8)nmol/L，无显著变化（P＞0.05 ）（图2）。

Fig 1 Effect of ET-1(1×10^-7mol/L) on ［Ca²⁺］_i in ventricular myocytes， (±s,n=9),*P＜0.01, vs control

R=rapid initial transient phase; S=sustained phase

图1ET-1(1×10^-7 mol/L)对心室肌细胞［Ca²⁺］_i的<