摘要目的和方法：采用RT／PCR和定量酶标标准化的测定方法，检测了先患(丙型或戊型)肝炎后患再生障碍性贫血和先患再生障碍性贫血后患丙型(或戊型)肝炎的阳性率，并与对照组比较。结果：血清组中HCV－RNA的阳性率分别是57.9%和28.9%，二者差异显著(P＜0.05)；HEV－RNA阳性率分别是24%和25.9%，二者差异不显著(P＞0.05)。在单个核细胞组中HCV－RNA阳性率分别为11.8%和10.5%；HEV－RNA的阳性率分别为0%和3.7%；HEV－RNA在粪便中的阳性率32%和37%，均无显著差异。结论：丙型和戊型肝炎病毒不直接影响造血细胞的基因表达，仅使造血微环境有一定改变，引起患者自身免疫反应，对造血有一定的影响。

The study on the relativity between hepatitis virus C orE(HCV,HEV) and the occurrance by applying

RT/PCR technology to aplastic anemia

GUO Xiu-Zhi,FAN Hong－Tao,LIANG Shi,TAN Guang-Xiao,YANG Li－Jian

Dept.of Hematology,Medical College of Jinan University,Guangzhou(510632)

Abstract AIM and METHOD:Virus infection may be one of the causes of aplastic anemia(AA).We adopt the RT/PCR technology to examine the positive rate of HCV－RNA(or HEV－RNA）for the purpose to reveal the relativity associated with the occurrance of AA.RESULTS:In two serum groups,the positive rates of HCV－RNA，those followed by AA(called irrelevant AA),those and AA followed by the hepatitis virus C(called relevant AA),are 57.9% and 28.9% respectively,the difference appears significant(P＜0.05)，the positive rate of HEV-RNA is 24% and 25%,while the difference is not stricking(P＞0.05).However,in mononuclear cell,the positive rate of HCV-RNA is 11.8% and 10.5%,HEV-RNA is 0% and 3.7% respectively,meanwhile,in stool,HEV-RNA is 32% and 37%,all are not stricking(P＞0.05).CONCLUSION：The occurrance of AA is not related to virus C and E directly,but virus may activate autoimmune response,which makes influence on micro circulation and interferes with hematopoietic function.

MeSHHepatitis E virus;Hepatitis C virus;Anemia,aplastic

国内丙型和戊型肝炎病毒的感染率较高，尤其是输血后患丙型肝炎的发病率有增高的趋势。本文用RT／PCR－国际标准化酶标的方法检测再生障碍性贫血(简称再障)患者血清和单个核细胞提取物中的HCV－RNA(hepatitis C virus-RNA)和HEV－RNA(hepatitis E virus-RNA)的阳性率，并对丙型(或戊型)肝炎有关再障和无关再障及正常人进行比较。

材料与方法

一、病例的选择：

1991～1997年间临床已确诊^［1］为再生障碍性贫血的患者，分成两组：(A)组为先患丙肝(或戊肝)后患再障，共34例(或25例)，其中男22例(戊肝18例)；女12例(戊肝7例)；年龄14～42岁，平均年龄29.2岁(戊肝28.1岁)。(B)组为先患再障后患丙肝(或戊肝)38例(戊肝27例)，其中男18例，女20例(戊肝男13例，女14例)。正常对照组为25名献血员，男15例，女10例，平均年龄24.1岁(19～30岁)。

先患肝炎后患再障，一般为再障发病前3个月以上患典型的肝炎症状，符合1990年全国病毒性肝炎学术会议修订的标准诊断。

二、试剂与仪器：

PCR扩增仪是美国PE公司生产的CT／I型。HCV－PCR试剂和酶标试剂均由黄道培先生(美国CLL公司)惠赠；HEV－PCR试剂盒由华美公司购入。

HCV－PCR引物

F1：5’－CGACACTCCACCATAGATCAC－3’。

R1：5’－ATGGAGCACGGTCTACGAGAG－3’。

F2：5’－TGTGAGGAACTACTGTCTTCA－3’。

R2：5’－CCTATCAGGCAGTACCACAAG－3’。

HEV－PCR引物

P1：5’－GCTATTATGGAGGAGTGTGG－3’。

R1：5’－CAGGGCCCCAATTCTTCTC－3’。

P2：5’－GCGTGGATCTTGCAGGCC－3’。

R2：5’－TTCAACTTCAAGCCACAGCC－3’。

三、样品处理：

取静脉血3 mL，2 mL加肝素抗凝，用淋巴细胞分层液按常规分离单个核细胞，取1×10⁵个细胞置于1.5 mL离心管内，加0.1 mL变性液，充分振荡摇匀，加0.1 mL的2mol/L乙酸钠(pH4.0)，1 mL饱和酚，摇匀，加0.2 mL氯仿／异戊醇(49∶1)，用力振荡10 s，置冰浴15 min，10 000 r／min 4℃离心20 min，取上层水相，加等体积异丙醇置－20℃1 h，使RNA完全沉淀，离心，用75%乙醇洗后干燥，溶解于TE缓冲液内，置－20℃保存备用。

余1 mL血自然凝固，取血清50 μL加裂解液100 μL于0.5 mL离心管内，混匀，置95℃15 min，10 000 r/min离心5 min，将沉淀溶于0.1 mL变性液(含4 mol/L 异硫氰酸胍，25 mol/L柠檬酸钠，0.5%十二烷基肌氨酸钠，0.1 mol/L β－巯基乙醇)备用。

四、RT／PCR扩增：

1.cDNA扩增：取0.5 mL的离心管，依次加入上述血清或单个核细胞提取备用液2 μL，10 U RNasin,10 pmol 引物，1 mmol dNTP,2.5 U 逆转录酶，反应缓冲液，总体积为20 μL。42℃保温60 min，混匀，95℃变性5 min，4℃3 min，加Taq酶0.5 U，做PCR扩增，94℃30 s55℃ 30 s72℃ 100 s，做35个循环。

2.PCR第二次扩增：取上述cDNA扩增产物10 μL于0.5 mL的离心管内，依次加入10 μL的10×PCR缓冲液，Taq酶2 U，dNTP 1 μL和5 pmol引物，反应体积30 μL，按94℃30 s55℃30 s72℃100 s(HEV－PCR按94℃45 s55 ℃ 45 s72 ℃ 60 s)进行35个循环，72 ℃延伸300 s。

3.电泳分析：取PCR扩增产物10 μL进行1.2%琼脂糖凝胶电泳(内含溴乙锭0.5 mg/L)，在紫外灯下观察与阳性对照迁移距离一致的荧光带(310bp)者为阳性结果。

4.酶标定量分析：取PCR扩增产物20 μL，加酶联接头液，反应液，显色液，中止液，置室温暗盒内反应30 min，在自动酶标仪上测定，波长为A₄₅₀nm读OD值，结果计算：

样品阴性对照(本底)A₄₅₀≤0.25;

样品阳性对照为A₄₅₀0.4～1.0；

样品测定值为A₄₅₀～A₄₅₀本底值≥0.4以上为阳性。

结果

一、血清：

1.先患丙肝后患再障的有关再障组患者酶标测定A₄₅₀平均值0.67(0.45～0.85)，电泳结果阳性(HCV－PCR阳性)18例，占18／34为52.9%；先患再障后患丙肝的无关再障患者酶标A₄₅₀值平均0.62(0.42～0.85)，电泳阳性的11例，占11／38为28.9%，二者比较差异显著(P＜0.01)。

2.先患戊肝后患再障的患者中HEV－PCR酶标测定A₄₅₀在0.40以上只有6例，平均值0.65(0.45～0.78)，电泳阳性6例，占6／25为24%，先患再障后患戊肝的无关再障患者中HEV－PCR酶标测定A₄₅₀为0.4以上7例，平均值0.62（0.44～0.72)，电泳阳性7例，占7／27为25.9%，二者比较差异不显著(P＞0.05)。

二、单个核细胞：

1.丙肝有关再障患者酶标测定A₄₅₀平均值0.65（0.41～0.82)，电泳结果阳性4例占11.8%；无关“再障”酶标测定A₄₅₀为0.65(0.41～0.79)，电泳阳性4例，占10.5%，二者相比较差异不显著(P＞0.5)。

2.戊肝“有关”再障患者酶标测定A₄₅₀值平均0.38(0.25～0.40)，电泳27例均为阴性，即0%。戊肝无关再障患者酶标测定A₄₅₀平均值为0.47(0.2～0.57)，电泳阳性仅1例，占3.7%。二者比较差异不显著。

Fig 1RT／PCR electrophoresis result of HCV－RNA

Lane 1：Positive control of MNC HCV－RNA

Lane 2：Positive control of serum HCV－RNA

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