摘要目的：探讨c-myc基因表达在血管平滑肌细胞增殖信号传导通路中的作用和采用反义c-myc寡脱氧核苷酸抑制血管平滑肌细胞(SMC)增殖的作用。方法：采用针对大鼠c-myc mRNA包括AUG在内的翻译起始区的前5个密码子的嵌合性硫代修饰的反义c-myc寡脱氧核苷酸(AS-ODN)，以lipofectin导入SMC后，通过细胞计数和³H-TdR掺入观察其对SMC增殖的抑制作用。结果：c-myc AS-ODN不仅对从静止状态刺激的SMC增殖有抑制作用，而且对处于增殖状态的SMC的增殖也有显著抑制作用，这种抑制作用可因加入正义c-myc ODN而减弱甚至消除，而且随着剂量的增加，抑制作用越来越明显。一次性应用c-myc AS-ODN可达到较持久的作用。而正义ODN和错配ODN对SMC增殖无影响。结论：c-myc AS-ODN以剂量依赖和序列特异方式抑制SMC增殖。c-myc基因表达在SMC增殖的信号传导通路中起重要作用。为采用c-myc AS-ODN抑制SMC增殖的反义战略防治再狭窄研究奠定了基础。

Inhibition of rat aortic smooth muscle cell proliferation by chimeric phosphorothioate

antisense c-myc oligodeoxynucleotide

WANG Jia-Ning, HU Da-Yi, MA Ya-Luan, GAO Tian-Xiang, LIU Bo

The Heart Cennter, Beijing Red Cross Chaoyang Hospital, Capital University of Medical Sciences，Beijing(100020)

Abstract AIM：Investigate the role of c-myc gene expression in the signal transduction pathways mediating smooth muscle cell (SMC) proliferation and the effect of chimeric phosphorothioate antisense c-myc oligodeoxynucleotide (AS-ODN) on rat aortic SMC proliferation.METHODS：Chimeric phosphorothioate c-myc AS-ODN targeting the 1st 5 codons of translation initiation region of c-myc mRNA was introduced by lipofectin and its inhibitory effect on SMC proliferation was observed by cell count and［³H］-TdR incorporation.RESULTS：c-myc AS-ODN markedly suppressed proliferation of not only SMC stimulating from quiescent state but also exponential SMC. The inhibitory effect of c-myc AS-ODN on SMC proliferation was decreased and even abrogated by adding sense c-myc ODN. The larger dose there was, the greater inhibitory effect of c-myc AS-ODN on SMC proliferation there was. A single administration of c-myc AS－ODN had lasting action.Sense c－myc ODN and mismatch c-myc ODN had no significant effect on SMC proliferation compared with control.CONCLUSIONS：c-myc AS-ODN inhibited SMC proliferation in a dose-dependent and sequence-specific manner. This investigation indicates that c-myc gene product is involved in the signal transduction pathways mediating SMC proliferation and provides a basis for future study of the potential role of antisenese strategy using c-myc AS-ODN designed to inhibit SMC proliferation for the prevention of coronary restenosis.

MeSHOligodeoxyribonucleotides, antisense; Genes, myc; Muscle, smooth; Cells

经皮腔内冠脉成形术(percutaneous transluminal coronary angioplasty, PTCA)已成为冠心病的主要治疗手段之一，但术后3～6个月内发生的再狭窄是影响PTCA远期疗效的限制因素，迄今尚无有效防治再狭窄的措施^［1］。反义核酸技术是近十年来兴起的技术。它的特异性和负调控靶基因的作用为再狭窄的防治带来了新的希望。

动脉平滑肌细胞(smooth muscle cell, SMC)的增殖是再狭窄形成的重要机制之一。c-myc基因表达是SMC从G₀／G₁期进入S期所必需的。多种引起SMC增殖的生长因子和血清刺激均导致c-myc基因表达增高。本研究采用针对大鼠c-myc mRNA包括AUG在内的翻译起始区的前5个密码子的嵌合性硫代磷酸修饰的反义c-myc寡脱氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide, AS-ODN)，通过阳离子脂质体lipofectin导入培养的大鼠SMC，观察其对SMC增殖的影响，以期探索一条抑制SMC增殖进而防治再狭窄的新途径。

材料与方法

(一)试剂：DMEM培养基、lipofectin、HEPES和胰蛋白酶购自GIBCO/BRL公司，胎牛血清(fetal calf serum, FCS)购自中国医科院天津血研所，³H-TdR购自中科院原子能研究所。

(二)ODN的合成和序列：ODN由美国Research公司合成。ODN 5′和3′端各3个磷酸二酯键中的一氧原子被硫取代，其它磷酸二酯键未行修饰。合成的ODN经HPLC纯化，冻干保存。正义(sense)序列5′ATG CCC CTC AAC GTG 3′;反义(antisense)序列5′CAC GTT GAG GGG CAT 3′；错配(mismatch)序列5′ CAC GTG GAG TGG CAT 3′。

(三)尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测ODN的稳定性：将处于指数生长期的SMC培养上清液(含20%FCS的DMEM)取出，分别在电泳前的不同时间，加入c-myc AS-ODN至SMC培养上清液中，使其浓度达到200 mg/L，置37℃体积分数为5%CO₂的孵箱中孵育。电泳时取1μL加入7μL缓冲液，2μL甲酰胺，混匀，于55℃加热5 min，再加2μL缓冲液，混匀，用微量进样器按顺序上样。加样前，先用1500V电压预电泳15 min。切断电流后，加入样品，使用1500V电压进行电泳。电泳结束后取下凝胶。EB染色1 h，紫外灯下观察照相。

(四)SMC的培养：方法参照文献^［2］。

(五)［³H］－TdR的掺入实验：方法参照文献^［3］。

(六)统计方法：实验数据采用SPSS软件处理，所有计量资料均先行方差分析。若方差齐性，多组之间的两两比较采用q检验；若方差不齐，进行秩和检验，多组之间的两两比较采用推广的t检验。

结果

(一)c-myc AS-ODN在细胞培养上清液中的稳定性：c-myc AS-ODN在细胞上清液中相当稳定，一直到孵育第7天，AS-ODN也没有明显降解，说明本研究所采用的嵌合性硫代磷酸修饰的ODN性能稳定，能够抵抗核酸酶的降解。

(二)c-myc AS-ODN对SMC增殖的抑制：

(1)c-myc AS-ODN对从静止状态刺激的SMC增殖的抑制：将SMC悬液接种于96孔培养板，孵育24 h后，换无血清的DMEM静止SMC 24 h，弃去培养液，加入含lipofectin 8μmol/L和c-myc AS-ODN 100 nmol/L DMEM培养液，4 h后换20%FCS的DMEM，分别于不同时间进行细胞计数，每组设3个平行孔。实验设正义ODN组，错配ODN组和对照组。结果显示，正义c-myc ODN和错配c-myc ODN对SMC增殖无影响，而c-myc AS-ODN与其它各组间差异均有显著(P＜0.01)。

(2)c-myc AS-ODN对处于增殖状态的SMC增殖的抑制作用：将SMC悬液接种于96孔培养板，孵育48 h后，换含8 μmol/L lipofectin和100 nmol/L c-myc AS-ODN的DMEM培养液4 h后，换20% FCS的DMEM，分别于不同时间进行细胞计数。每组设3个平行孔。实验同时设正义ODN组、错配ODN组和对照组。结果显示，c-myc AS-ODN能显著抑制增殖状态SMC的增殖，与其它各组间相比，差异有显著，P＜0.05。

(三)Lipofectin/AS-ODN作用于SMC 4 h后，再次加入c-myc AS-ODN是否进一步抑制SMC增殖：lipofectin/AS-ODN处理SMC 4 h后，再次加入c-myc AS-ODN并不能显著增加首次使用c-myc AS-ODN抑制SMC增殖的效果。说明一次性使用c-myc AS-ODN对SMC增殖抑制作用的持久性，无需反复应用。

(四)生长抑制率与c-myc AS-ODN剂量的关系(图1)：生长抑制率=正常对照组细胞数-实验组细胞数/正常对照组细胞数-接种细胞数×100%。c-myc AS-ODN对SMC增殖的抑制存在着明显的剂量效应关系，生长抑制率=0.36192+0.15727 lgConc,其中Conc代表c-myc AS-ODN的浓度，单位为μmol/L,相关系数r=0.9867，P＜0.01。

fig 1 Curve showing dose-dependent growth inhibition of SMC after c-myc AS-ODN administration. Percent inhibition was calculated at day 7 by comparison of cell number in c-myc AS-ODN treated cells with that of control group.

1不同浓度的c-myc AS-ODN对生长抑制率的影响(五)正义c-myc aS-ODN对c-myc AS-ODN抑制SMC增殖的逆转作用(图2)：在c-myc AS-ODN浓度不变的情况下，改变正义与反义ODN的浓度比，可以看出，随着正义c-myc aS-ODN剂量的加大，c-myc AS-ODN对SMC增殖的抑制作用逐渐减弱，在正义ODN与反义ODN浓度之比为10∶1时，正义ODN几乎完全消除反义ODN抑制SMC增殖的作用。

fig 2 Growth curves of SMC showing that the growth-inhibitory effect of c-myc AS-ODN is prevented by excess of sense oligomers. Rat SMC were incubated with 100 nmol/L c-myc AS