摘要目的：初步了解哺乳类细胞非定标性突变形成是否与以蛋白质磷酸化级联反应为主要形式的细胞信号传导通路有关；方法：采用［³²P］体内预标记及凝胶双向电泳方法差异显示甲基硝基亚硝胍(MNNG)处理组和对照组磷酸化蛋白，蛋白质免疫印迹杂交试验初步鉴定差异显示蛋白斑点性质；结果：在处理组发现两个与对照组不同的蛋白斑点，分子量分别在68×10³和43×10³附近，与抗酪氨酸磷酸化蛋白抗体未发生阳性反应；结论：根据差异显示蛋白斑点的分子量和印迹杂交试验结果，初步认为所见蛋白斑点可能为丝/苏氨酸磷酸化蛋白，且可能为丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)成员。

Differential display of phosphorylated protein in MNNG treated vero cells

SUN Xue-Min, YU Ying-Nian, CHEN Xing-Ruo

Department of Pathophysiology and Laboratory of Medical Molecular Biology, Hangzhou (310031)

Abstract AIM：To explore the potential relationship between nontargeted mutagenesis and the cascades of protein phosphorylation of signal transduction pathways in cells.METHOD：Differential display of phosphorylated protein in cells treated with MNNG (methylnitronitrosoguanidine) and those with dimethyl sulfoxide (control) were performed with ［³²P］ incorporation in vivo; Western blotting test was employed to identify the property of the protein.RESULTS：There are two differential displayed phosphorylated proteins reacted negatively with antiphosphotyrosine in MNNG treatment cells.CONCLUSION：The molecular weight of two proteins and the results of Western blot suggested that the two differential displayed phosphorylated proteins may be Ser/Thr phosphoproteins and probably members of the MAPK.

MeSHMethylnitronitrosoguanidine；Mutation; Proteins; Signal transduction

非定标性突变是发生在DNA损伤剂攻击部位之外的突变。在其特征和机制的研究方面，我们已经获得一些重要的线索，如突变的DNA序列特异性，提示与定标性突变有着不同的生成机制^［1］；突变发生的时相关系，提示突变的形成需要有新合成蛋白质的参与^［2］。最使我们感兴趣的是在哺乳类细胞基因转录或翻译被阻断的情况下，突变率的变化截然不同^［3］。这一方面可以肯定非定标性突变形成过程中存在基因表达的改变，另一方面也说明了这种改变的复杂性。

近年来对DNA损伤反应的深入研究为探索非定标性突变形成机制提供了丰富的信息和广阔的思维空间。已知DNA损伤剂可引起多达几十种基因的表达改变或其产物修饰改变，最终细胞或者因获得修复而生存，或者走向程序性死亡。但是生存的细胞内仍可留有DNA损伤剂作用的烙印，即各种突变的存在。从最初的基因表达改变到最后的结局之间由细胞内一系列信号传导系统串联，其中蛋白质磷酸化级联反应是最主要的方式。有的蛋白激酶可直接由DNA损伤激活，如DNA依赖性蛋白激酶(DNA-activated protein kinase, DNA-PK)^［4］，有的间接通过细胞膜上的酪氨酸激酶激活，如丝裂原激活的蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase, MAPK)^［5］。

由于非定标性突变不是DNA直接受攻击的结果，那么在损伤部位到突变部位之间必然存在特定的联系。这种联系是否属于蛋白质磷酸化级联反应?是何种类型的磷酸化反应?我们试图通过比较甲基硝基亚硝胍(N-methyl-N’nitro－N-nitrosoguanidine, MNNG)处理和非处理细胞磷酸化蛋白的差异显示来初步回答这个问题。

材料与方法

(一)细胞分组：非洲绿猴肾vero细胞用含10%小牛血清的DMEM(Gibco)常规培养，实验时将细胞分为3组：

A组：MNNG(Fluka)处理组，0.2μmol/L MNNG处理2.5h；

B组：MNNG+Chm(cycloheximide, Sigma;蛋白质合成抑制剂)处理组，MNNG处理结束后，用含1 mg/L Chm的培养基继续处理12h；

C组：DMSO(二甲基亚砜，MNNG的溶剂)对照组，0.2% DMSO处理2.5h。

(二)细胞预处理和同位素预标记：3组细胞用全培养基培养24h，无磷酸盐的DMEM(Sigma)培养基作磷饥饿处理12h，在分别以含MNNG(A、B组)和DMSO(C组)的无磷培养基处理2.5h后，用含［³²P］正磷酸盐(Dupont^TM,比活度3.7×10¹⁰Bq/mmol，放射强度3.7×10¹¹Bq/L;在细胞培养基中的浓度为3.3μmol/L，放射强度为2.442×10¹⁰Bq／L)的无磷培养基预标记12h，其中B组培养基中同时含有1mg/L Chm。

(三)制备细胞蛋白样品：标记后的细胞用胰蛋白酶消化，将细胞悬液移于1.5mL Eppendorf管，用PBS清洗3次，吸净残液，每管加样品溶液(10% SDS，0.15mol/L DTT)30μL，煮沸5min，冷却后加120μL抑蛋白酶溶液，20μLDNase-RNase,混匀，室温放置5min，12000r/min，离心5min，上清液煮沸3min，冷却后上样电泳。

(四)蛋白质双向凝胶电泳：按Bio-Rad仪器说明书提供的方法配制等电聚焦凝胶柱，每种蛋白质样品上样30μL，连续电泳20h(电压200V 2h，500V 2h,800V 16h)后，将柱胶放置到12% SDS凝胶板上缘，在柱胶一端加5μL蛋白质分子量标准(Gibco,high range),25mA/板电泳1h，40mA/板电泳6.5h。

(五)蛋白质印迹电转移：电泳结束后，取下凝胶，用去离子水略事漂洗后将凝胶放入电转移夹，在LKB 2005 Transphor Electroblotting Unit上将凝胶蛋白转移至硝酸纤维素膜(NC膜)。电转移条件：电压50%，电流0.6～1.2Am,时间2.5h。

(六)压片、读片：NC膜用去离子水略漂洗后以保鲜膜封闭，放入暗盒，-70℃曝光12～36h后显影。

(七)蛋白质免疫印迹杂交(Western blotting):分别用购自Boehringer Mannheim公司的抗磷酸酪氨酸蛋白检测试剂盒(antiphosphotyrosine-POD,抗体1)和Immunotech公司的抗磷酸酪氨酸抗体(phosphotyrosine-KLH,抗体2)对差异显示的磷酸化蛋白进行Western blotting实验。抗体1操作按试剂盒说明书。NC膜在Stripping buffer中50℃缓摇1h，TBS洗膜10min×3次，封闭液室温处理1h，抗体1室温处理2h，TBS洗膜5min×6次，化学发光液反应60s，暗盒曝光5min；抗体2在膜用封闭液处理后室温温育2h，碱性磷酸酶酶联二抗处理1 h，继之生色反应。阳性对照(phosphotyrosine-BSA)试验均同步进行。

结果

在总共3次实验中，第一次实验将细胞分为A和C两组，第二和第三次分为A、B和C三组，三次A组和两次B组照片均在相似位置上发现两个蛋白斑点，分子量分别在68×10³和43×10³附近，而C组在相应位置无明显斑点。见图1(A、B：第一次实验；C：第三次实验)。

Western blotting实验中，NC膜上磷酸化蛋白相应位点未出现明显的印迹斑点。阳性对照膜也无斑点显现。为检验阳性对照的质量，我们做了两方面的工作：1)将抗体1(anti-phosphotyrosine-POD)直接点膜后与化学发光剂反应，发光强烈，证明抗体的发光反应正常；2)将phosphotyrosine-BSA直接点膜，分别用抗体1和抗体2与之反应，继之化学发光或酶联显色，均未见明显蛋白斑点。提示试剂盒标准抗原可能存在质量问题。

Fig 1 Differential display of phospho proteins

in vero cells pretreated with MNNG or DMSO

A: DMSO；B:MNNG；C：MNNG+Chm； →:Phospho protein

1MNNG或DMSO预处理的vero细胞磷酸化蛋白的差异显示

讨论

在DNA损伤反应研究中发现，紫外线、离子辐射、烷化剂、抗肿瘤药物和过氧化氢等DNA损伤剂可诱导细胞内多种基因快速或持续表达，尤其在对紫外线的研究中有证据表明它可与生长因子共用膜上受体及其它信号传导组成成分^［5］。此外，已有实验证实烷化剂甲基磺酸甲酯、肿瘤坏死因子和白介素1也通过细胞膜src蛋白(src癌基因产物，具有酪氨酸激酶活性)经生长因子通路影响核内基因表达^［6］。虽然对DNA损伤剂引起细胞内信号传导的初始信号出自何处(即由核内DNA损伤部位发出信号返回到膜上还是直接由膜上发出信号)尚存争议^［5］，但它们肯定动用了细胞内信号通路而产生对细胞的各种效应，如DNA损伤、DNA修复、突变形成以及细胞凋亡。已有的研究结果也提示MNNG通过影响基因表达而最终导致非定标性突变频率的变化^［3］。

蛋白质磷酸化反应是细胞信号传导的主要方式。大多数生长因子受体具有酪氨酸激酶活性，可使下游蛋白分子中酪氨酸磷酸化；Ras通路中Raf及其后续分子则以丝/苏氨酸激酶为主，其中MAPK是细胞内外各种来源信号的汇集点，它有三种激酶类型，分别为：细胞外信<