摘要目的：观察N-甲基-左旋精氨酸(L-NNA)对基底膜振动速度(velocity of basilar membrane vibration, BMV)的影响，了解一氧化氮(NO)对耳蜗外毛细胞(cochlear outer hair cells, COHCs)的作用。方法：杂色豚鼠25只，麻醉、手术准备后用1.6 mmol/L的L-NNA 8 μL行耳蜗底圈鼓阶内灌注，测试BMV、听神经复合动作电位(cAP)、蜗内电位(EP)，记录用直流电脉冲诱发的BMV。结果：蜗内灌注L-NNA后，BMV大约提高了3倍，耳蜗微音器电位振幅略有下降，而EP无明显变化。这一现象只出现在耳蜗灵敏度仅有轻微下降情况下，正常听敏度耳蜗或耳蜗功能严重损伤时BMV无提高作用。结论：NO可能促使耳蜗的声损伤加重，L-NNA可阻断NO的合成，从而起到保护耳蜗的作用。

Effect of nitric oxide synthase blockade on basilar

membrane velocity in guinea pigs cochlea

GUO Meng-He, HUANG Yi-Le

Department of Otolaryngology, Zhujiang Hospital, The first Military Medical University, Guangzhou (510282)

AbstractAIM：The effects of NO synthase (NOS) blockade on the cochlear outer hair cells were observed. N-nitro-L-arginine (L-NNA) was used and the vibration velocity of basilar membrane (BMV) was observed.METHODS: Pigmented guinea pigs were anesthetized and surgically prepared to permit infusion of L-NNA into the scala tympani of basal turn of cochlea. The basilar membrane ( BM) vibration and compound action potential (cAP), endocochlear potential (EP) and cochlear microphonic (CM) were monitored. 8 μL of 1.6 mmol/L L-NNA was infused into the perilymph of scala tympani. BM velocity responses elicited with direct current (DC) pulses were recorded.RESULTS: BMV was increased by approximately 3 folds following infusion of L-NNA. CM decreased by a small amount and there was no significant change in EP. This phenomenon occured only in cochlear sensitivity has been lost less than 40 dB. NO improvement in BM velocity if the cochlear sensitivity was normal or was severely damaged.CONCLUSIONS: The results imply that NO could promote the injury of cochlea when noise is exposed. L-NNA may act as a guardian when facts of trauma act on cochlea.

MeSHBasilar membrane; Vibration; Electric stimulation; Nitric oxide

一氧化氮(nitric oxide, NO)对耳蜗的自身的稳定作用以及它对Corti器的作用至今尚不清楚。Ohlsen等^［1］首先发现硝普钠引起耳蜗听敏度的损失。Chen,等^［2］发现NO能直接作用于COHCs水平，影响离体毛细胞的电能动性，但对在体COHCs电能动性的作用难以检测。为了评价NO对在体COHCs的直接作用，我们用电刺激诱发基底膜(BM)振动，观察蜗内灌注L-NNA后对耳蜗的影响。

材料和方法

1.实验动物：杂色豚鼠30只，雌雄不拘。体重250～450 g，分成3组。L-NNA组15只，用于观察L-NNA对耳蜗的作用。5只空白对照组，仅用林格液作蜗内灌注。5只为内淋巴电位(endolymph potential, EP)组，专用于观察L-NNA对蜗内电位的影响，另5只为耳聋组。动物麻醉初次剂量用苯巴比妥钠15 mg/kg腹腔内注射，氯胺酮40 mg/kg肌注。以后每隔1h补充氯胺酮1个剂量，每4h或根据需要补充苯巴比妥半个剂量。豚鼠固定于头架上，心电检测、肛温保持在37.5～38℃。气管切开并插管，保持自主呼吸。腹侧进路，充分打开听泡，暴露耳蜗和圆窗龛。银-氯化银球电极置于圆窗龛作为记录听神经复合动作电位(compound active potential, cAP)、耳蜗微音器电位(cochlear microphone, CM)的记录电极。银-氯化银丝电极插入右颈部软组织内作为参考电极。切断镫骨肌键和鼓膜张肌。记录2kHz～32 kHz( 2 kHz步进)的cAP阈值，正常动物应佳于30 dB SPL。

2.耳蜗开窗：在耳蜗底圈鼓阶外侧壁距圆窗龛约2.5 mm处，削薄骨壁，开一个直径约0.4 mm的小

窗(BMV测试窗)。紧靠该窗，在鼓阶侧开另一个直径约0.1 mm的小孔。将3 T铂-铱电极经此孔插入鼓阶内。在该小孔对应的前庭阶骨壁，也开一个更小的孔，将1 T铂-铱电极置入前庭阶。这一对电极作为电刺激电极。再次复查cAP阈值，L-NNA组动物的cAP阈值应佳于40 dB。

3.刺激电流信号：由微机控制产生的直流方波，持续时间为1.5 ms，间隔48.5 ms，延迟1.0 ms，输入到光隔离恒流电刺激器的TTL端，由电刺激器输出100～500 μΑ的直流脉冲到上述跨在蜗管两侧的刺激电极。

4.基底膜振动测试：将动物头下垂，使基底膜保持在大致水平位置，将直径约为20 μm的镀金玻璃微珠沉到基底膜上作为激光反射物。激光经光学显微镜耦合后，聚焦在选定的玻璃微珠上。用激光多普勒测速仪(OFV-1101，美国Polytec公司)分析BM振动信号，其速度信号经12位AD采样(采样速率120 kHz)、叠加平均，并用谱分析仪(SR-760，美国Stanford公司)分析频谱。1.6 mmol/L的L-NNA用林格液稀释，pH保持在7.4，渗透压大约为300 mOsm。用微量注射器抽取8 μL，用微量注射泵经拉细的聚乙烯管用4 min以上时间缓慢注入鼓阶。在注入L-NNA前以及注射后不同时间，测定BMV、记录cAP,CM和EP。为使EP值可靠，在注入L-NNA前，测定EP值1 h，使其保持平稳，注射L-NNA后连续测定EP值2 h。

结果

1.基底膜振动速度提高与听力的关系：L-NNA作为NOS的阻断剂，能明显地影响电刺激诱发的基底膜振动速度。图1示300 μA直流脉冲注入到前庭阶(正极)和鼓阶的BMV约为300 μm/s(峰-峰值)，而在注入电流前仅为100 μm/s，本图是试验中较为典型的例子。在L-NNA组15只豚鼠中有10只豚鼠在灌注L-NNA后有BMV的提高。当用低强度电流刺激(100 μA)时，BMV提高率为灌注前的1.3～6.0倍。L-NNA组中5只豚鼠在灌注L-NNA前听敏度完全正常，灌注L-NNA后未见BMV的提高现象。另5只豚鼠听力损失严重，亦未见BMV的提高。

Fig 1 The vibration velocity of basilar membrane

before infusion of L-NNA (Fig 1A) and 65 min

after infusion of L-NNA 1.6 mmol/L(Fig 1B)

图1 基底膜振动速度波形

2.基底膜振动速度提高与刺激电流强度的关系：BMV的提高程度与电流刺激强度有关。图2示8只豚鼠在灌注L-NNA前、后不同电流强度与BMV的关系。当电流强度最小时(100 μA)BMV提高最多。图3示蜗内灌注L-NNA 140 min内，3种不同电流强度的BMV提高的相对值，同样，在100 μΑ时BMV速度提高倍数最高。我们观察到，当蜗内灌注L-NNA后1 h BMV提高程度最大。由于蜗内灌注L-NNA后引起明显的BMV提高，相应要影响到cAP的阈值，所以有必要观察是否同时伴有听神经活动的增强。图4示其中1只豚鼠的cAP阈值在18 kHz处改善了9 dB( 18 kHz为玻璃微珠所在处的最佳频率点)。该动物cAP阈值在灌注前略有损失，灌注后阈值基本上恢复到正常水平。

Fig 2 The basilar membrane velocity before and after

infusion L-NNA vs current level (±s, n=10)

图2蜗内灌注L-NNA前、后不同

电流强度刺激的基底膜振动速度

Fig 3 Normalization of enhancement of BMV

vs current level in different time

图3不同电流强度下及不同时间的

基底膜振动速度归一化增生率

Fig 4 The thresholds of cAP in 20 guinea pigs and threshold

of an animal before & after infusion of L-NNA

The solid line is the mean value of threshouds in normal guinea pigs. The dotted line is a standard deviation.The solid circle is the threshold of guinea pig before infussion of L-NNA.The open circle is the threshold 40 min after infussion of L-NNA

图420只豚鼠cAP阈值及一只豚鼠

蜗内灌注L-NNA前后的cAP阈值