摘要体外连续培养的细胞在有限次数的细胞分裂后，丧失合成DNA及分裂的能力，最后导致增殖能力的丧失，但基本代谢过程仍能维持，这种现象称为复制衰老。本文讨论了复制衰老现象存在的普遍性，描述了衰老细胞的特征，对复制衰老和生物体衰老之间的联系进行了重点分析。现有的研究虽然还不完全，但都提示复制衰老是生物体衰老在细胞水平上的反映，并充分肯定了复制衰老是一个较好的研究机体衰老的模型。

学科分类号Q255；R592

Systemic Aging and Replicative Senescence: In Vivo and in Vitro

ZHAO LiangZHANG Zong-YuTONG Tan-Jun

（Department of Biochemistry and Molecular Biology, Health Sciense Center, Peking University, Beijing 100083）

AbstractCultured cells lose the ability of DNA synthesis, mitosis, and finally the ability of cell proliferation after they have undergone a finite number of population doublings in vitro, though the cells still maintain the basic metabolic process. This is termed replicative senescence. We review the prevalence of replicative senescence, summarize the features of senescent cells, and then focus on the links between systemic aging and replicative senescence. The present knowledge, albeit still incomplete, proposes that replicative senescence is a reflection of systemic aging at cell level, and it fully confirms replicative senescence as a good model for the research of systemic aging.

Key wordsReplicative senescence; Systemic aging; Cell proliferation; Biomarkers

生物体衰老是一复杂的、具有不同器官和系统的数不清的一系列特定变化的过程。生物体作为整体衰老过程的研究有一些难以克服的障碍，这不仅包括衰老本身的复杂性而且也包括与不同个体相联系的广泛的异质性。此外，要将正常的衰老与生命过程中的疾病效应相区分确实存在很大困难。因此，体外培养传代的人类细胞是一个简化的，在控制条件下具有吸引力的机体衰老研究模型。

自1907年Harrison首创组织培养法以来，体外细胞培养很快被用于衰老的研究。1961年，Hayflick及Moorhead证明了体外培养的人类正常成纤维细胞的寿命是有限的。4年后，Hayflick^［1］发现，连续培养的人二倍体细胞株，经过一段旺盛繁殖期(一般不超过1年)后，即出现形态变化，停止有丝分裂，直至死亡。Hayflick将这种正常人体细胞在体外分裂潜能受限制的现象称为细胞衰老，或者更准确地说，复制衰老。正常细胞在体外培养中不能无限分裂的现象提示：复制衰老可能是生物体生命周期在细胞水平的重演。也就是说，体外细胞培养中的复制衰老可以反映体内衰老发生的过程。

成纤维细胞及成纤维样细胞进行体外培养时，其典型的生活史是：经历一段快速增殖期和一定次数的群体倍增后，进入增殖活力下降期，最后成为一个不能对生长因子作出增殖反应的细胞群^［2］。它们虽然丧失了DNA合成能力，不能增殖，但仍保持代谢活性。在增殖活力下降期内，细胞获得了新的性状，与老年生物体内的细胞相似，称为衰老细胞。衰老细胞在培养时逐渐积聚，即使非常年轻的培养细胞群也总是含有比例很小的少数衰老细胞。此衰老细胞在培养细胞群的整个生命期中百分比逐渐增大，直至所有细胞均进入衰老状态^［3］。复制衰老发生的基础是培养细胞群体倍增的次数，而不是培养时间。它是细胞分裂而不是时间的结果。复制衰老发生时的群体倍增次数取决于细胞供体的种属、年龄和遗传背景。

一、复制衰老的普遍性

大多数生物学家认为复制衰老现象不是细胞培养的人为产物。除了最早发现的人类二倍体成纤维细胞，现知许多其他类型的人类细胞也存在复制衰老现象，如表皮角质细胞，平滑肌细胞，晶状体上皮细胞，神经胶质细胞，内皮细胞，T淋巴细胞以及肾上腺皮质细胞^［4］，其他种属来源的成纤维细胞也可见到这一现象。因此，任何牵涉以上细胞类型增殖稳态改变的因素均能影响其生理性衰老，并与衰老相关病理学相联系。事实上，已发现免疫系统功能随年龄增加而下降的原因是T细胞增殖反应能力的下降或丧失^［4］。

高等生物子代细胞可从母代细胞继承“复制年龄”，细胞培养传代引起的衰老细胞由此不断积聚直至细胞全部衰老。而某些单细胞生物则与此不同，如啤酒酵母，其子代细胞并不严格继承母代细胞的复制年龄。啤酒酵母的子代细胞与母代细胞易于区分，就单个细胞而言它也发生衰老，但在群体水平上则表现为永生化。除啤酒酵母外，目前尚未在其它种属来源的细胞培养中发现这样的细胞，即它们发生衰老但不将复制年龄遗传给子代细胞^［5］。

现认为，可分裂的细胞除极少数例外，均发生复制衰老。高等哺乳类动物，可能只有2～3种细胞具有不受限制的分裂潜能。生殖细胞是其中一种。虽然生物的每一个体注定都要衰老死亡，但它们可以通过生殖细胞系的无限复制达到永生。另一种是肿瘤细胞，大多数肿瘤细胞也是无限复制永生化的。因此，复制衰老除被认为是生物体衰老在细胞水平上的表现外，还被认为可能是体内的一种肿瘤抑制机制。此外，各种组织中的干细胞，例如造血干细胞，可能也是一种无限复制永生化的细胞。

二、衰老细胞的特征

目前衰老细胞的判断标准不多，公认的衰老细胞的特征有：

(一)衰老细胞不可逆地丧失增殖能力衰老细胞的细胞周期稳定地、不可逆地阻滞于G₁期，丧失了对有丝分裂原的反应能力，不能进行DNA合成，不能进入S期，但在很长一段时间内仍维持代谢活性。虽然许多基因仍保持对有丝分裂原的可诱导性，但一些细胞周期行进必需的关键生长调节因子受到抑制。例如，正转录调节因子c-fos的抑制对于G₁早期阻滞有重要作用，衰老成纤维细胞中其特异转录因子的结合活性下降^［6］。Atadja等^［7］认为p53蛋白对G₁期阻滞有重要的影响。他们报道，虽然年轻和衰老的成纤维细胞中p53的表达水平相似，但在细胞衰老过程中，p53蛋白的体外DNA结合活性及体内转录活性增加了好几倍。p53蛋白阻遏衰老细胞生长的机制可能是通过与DNA结合，诱导p21的表达。已有报道p21在失去增殖能力的衰老人成纤维细胞中的表达水平上升了10～20倍（Noda等．1994）。P21可抑制细胞周期蛋白(cyclin)依赖的蛋白激酶的活性及增殖细胞核抗原(PCNA)的功能，因此可阻断RB1蛋白的磷酸化，而衰老细胞中RB1蛋白正是低磷酸化的。这导致与RB1蛋白结合的转录因子E2F不能释出，使细胞周期行进至S期所必需的许多重要基因不能激活，因此，细胞周期被阻滞于G₁期。

(二)衰老细胞的形态、功能均发生变化形态学上，可见衰老细胞体积增大，胞体变平；功能上也发生了有选择的、特异改变。如真皮的成纤维细胞，从制造胶原变为降解胶原^［8］。按照稳定且不可逆的生长阻滞及功能改变状况看，衰老细胞类似终末分化细胞，但二者不完全等同。例如，衰老和终末分化的黑色素细胞均不能磷酸化EPK2蛋白，p21均上升，但只有终末分化细胞才表达大量的p27及黑色素细胞特异转录因子（MITF）^［3］。

(三)衰老细胞，如人成纤维细胞衰老时获得了抵抗细胞凋亡的能力^［9］衰老成纤维细胞中bcl-2（ced-9）表达量增高，并且在撤除血清后其表达量也不象年轻细胞那样低。这使得衰老成纤维细胞抵抗凋亡，长期存活。这或许可以解释为什么衰老细胞在体内难以清除，随年龄增加在组织中积聚。

总之，衰老细胞不能分裂，但仍维持代谢活性，形态、功能发生了变化，某些类型的细胞衰老时不易凋亡。因此，衰老细胞的表型在细胞生活史中是独特而稳定的。

三、复制衰老与生物体衰老的联系

对于生物衰老的研究，其中心问题之一就是体外衰老是否与生物体整体衰老有联系，用体外培养细胞进行的研究是否与生物整体的衰老相关。也就是说，体外细胞衰老过程的研究是否有助于阐明体内衰老的基本过程。

1965年Hayflick最早提出复制衰老是“衰老在细胞水平的表现”^［1］。虽然有不同意见，但大多数生物学家认为复制衰老与生物体整体衰老相关，是体内衰老现象的一种体外反映。随着生物体年龄的增加，衰老细胞不断在体内积聚。这种理论获得了越来越多的实验证据的支持。

(一)供体的年龄虽然不同作者得出的群体倍增数与供体年龄的关系略有差别，但取自老年供体的细胞在衰老前群体倍增的次数要小于那些取自年轻供体的细胞^［10］。

Hayflick(1965)报道13株人胚肺成纤维细胞达到衰老时的分裂代数为35～65代，平均48代；而成年人的成纤维细胞株分裂代数只有14～29代。可见人胚肺成纤维细胞分裂代数明显高于成年人。

Martin等(1970)报道，用取自胎儿到90岁老人的上臂皮肤标本100份进行体外传代培养时，分裂代数随年龄增加而减少。每增1岁，细胞分裂代数平均减少0.2代，虽然数据变异较大，但这种递减是极