摘要骨髓间质干细胞是多能细胞，可分化成为间质组织，包括骨、软骨、脂肪、肌腱、肌肉和骨髓基质。在体外培养时，细胞贴附生长，呈成纤维样细胞表型，通过诱导可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞或肌肉细胞等。本文综述间质干细胞在体内和体外定向分化的研究进展，并探讨其应用前景。

学科分类号R318．01

130年前，德国病理学家Cohnheim 在研究伤口修复时，就提出骨髓中可能存在非造血组织的干细胞。直到20世纪70年代中期，Friedenstein等才首次报道，骨髓标本中小部分贴附细胞在培养过程中能够分化形成类似骨或软骨的集落^［1］。后来的研究表明Friedenstein粗糙分离所得到的细胞是多能的，可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞。因此，骨髓基质中的这种多能细胞，由于能够分化成为多种中胚层来源的间质细胞，而被称为间质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)。利用贴附方法分离的细胞实际上是多种细胞的混合，而非克隆化的。有趣的是，Friedenstein等证实贴附细胞传20或30代后，包埋在有孔的胶囊中，植入大鼠腹膜仍可分化为纤维组织、骨和一些软骨^［2］。1999年Pittenger等从人的髂骨骨髓样本中分离得到了MSCs^［3］，流式细胞术分析表明分离的细胞群体表型单一；在体外不同分化条件的诱导下，可以形成成骨细胞、软骨细胞或脂肪细胞；并且克隆化得到的细胞具有类似的分化特性，充分证明骨髓基质中MSCs是多能干细胞。

骨髓间质来源的细胞，形态成纤维样，可聚集成均匀的集落，细胞表面蛋白如SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124等呈阳性，但CD14、CD34和CD45造血谱系标记则呈阴性^［3］。因此这些细胞明显不同于其它CD34表面抗原阳性的骨髓成纤维细胞。培养的MSCs合成细胞外基质，包括I型胶原、IV型胶原、纤粘连蛋白和层连蛋白。

目前，MSCs鉴定的方法都是通过在培养过程中出现分化表型，然后逆推得知是否为间质干细胞，尚无直接方法可鉴定得到MSCs，这是因为至今还未能筛选到MSCs特有的标记分子。对CD14、CD34和CD45的阴性反应在筛选时可作为一定的参考依据。

一、体内MSCs的分化

Pereira等（1995）通过动物实验检测了MSCs在体内的走向^［4］。他们从表达突变I型胶原基因的转基因小鼠的骨髓中分离得到MSCs。将其体外培养扩增后，注入经X-射线处理的同源正常小鼠的骨髓。用PCR检测供体MSCs的突变I型胶原基因，一个月和五个月后，在多种组织中，供体细胞占组织中细胞数目的1%～12％；在正常鼠骨碎片培养的第三代细胞中检测到突变胶原基因mRNA的表达，软骨中虽存在有突变I型胶原基因的细胞，但突变基因不表达。标记基因在骨中表达而在软骨中不表达，说明 MSCs后代的基因的表达具有组织特异性。

这些实验表明，供体MSCs首先可替代机体骨髓中MSCs的一部分，然后进入正常的生物循环，外源的MSCs能够掺入到不同的组织，这为基因治疗提供了细胞基础。另外，突变的I型胶原基因在软骨中存在而不表达，表明MSCs的后代在进入不同组织之后，获得了靶组织的表型。这些结果虽然不能确定MSCs是组织中间质细胞祖细胞的唯一来源，但是至少证明MSCs能起到十分重要的作用。培养扩增的MSCs在体内可定向成骨、成软骨或成肌腱分化，可能是不同组织的微环境含有不同的因子，促进MSCs向不同谱系分化。

（一)成骨分化Kadiyala等（1997）在大鼠股骨的骨干做8mm的缺损后，用多孔羟基磷灰石/磷酸三钙圆柱体、圆柱体＋新鲜骨髓或圆柱体＋同源大鼠的MSCs填充。结果表明，装载MSCs的样本，细胞分泌骨基质，成骨分化很快。定量组织学评估，术后第4周，再生骨中的基质达到20％，第8周达到40％以上；而无细胞的样本不超过10％，加骨髓的只有17％。说明装载MSCs的圆柱体在股骨损伤修复中成骨效果比以前报道的方法好，也比骨形态形成蛋白（bone morphogenetic protein,BMP）复合材料的效果好。Bruder等（1998）将人的MSCs在体外培养扩增，贴附在生物材料上修复成年无胸腺大鼠骨损伤，也得到好的结果。

（二)成软骨分化由于关节软骨缺乏自身修复能力，所以软骨损伤一直是困扰人们的难题。Robinson等（1993）将成年兔骨髓的MSCs在体外培养扩增，装载在生物材料上修复软骨损伤，在种植6周和6个月后，通过生化、组织学和生物力学检测，可形成典型的透明软骨。Caplan等（1997）在兔膝部股骨髁作一个全厚的软骨损伤，结果表明在支持载体上装载适当数目的关节软骨细胞或自身MSCs细胞，能够重新合成关节软骨，修复损伤。

（三)成肌腱分化Young等（1998）利用培养自体的MSCs修复兔肌腱的损伤。他们将MSCs悬浮在胶原凝胶的载体上，在兔的跟腱作1cm长的断口损伤后，把细胞-凝胶复合物种植在肌腱的接缝上，在4、8、12周后，用生化和组织学标准评价肌腱的修复。用MSC处理的肌腱，与对照相比具有更大的横切面，胶原纤维的装配也比对照好；与对侧用肌腱细胞处理的接缝相比，在负载的结构和物质特性上要好两倍，而且负载性能继续改善。结果显示对于大的肌腱损伤，装载MSCs的种植物能够使损伤的肌腱在生化特性、结构和功能上得到修复。

MSCs与生物材料相结合，能够修复骨、软骨、肌腱等各种组织的缺损，这是组织工程中的新领域。迄今为止，所有的实验仅局限在用小动物的MSCs修复动物本身的缺损，或用人的MSCs来作动物实验，离临床应用尚有很大的距离。需要进一步研究，使其能够在大动物和与人类相近的灵长目动物身上得到验证，以便将来更好地用于临床。

二、在体外MSCs向多种类型的细胞分化

MSCs在体外培养时，保持干细胞的特性自身不断地增殖，在不同诱导条件下能够向不同谱系分化。许多实验室的研究表明，培养的MSCs能够自动分化形成不同的分化细胞。各个实验室的培养方法不尽相同，不能证明它们所分离的是否为相同细胞。一种解释是，细胞的分离和克隆、体外培养条件均可能导致这些细胞失去原先存在的多能特性；另一种解释是骨髓中的某些细胞可能代表祖细胞，具有有限的分化潜能。

通过密度梯度离心从狗或成人骨髓分离的MSCs，用地塞米松、β-磷酸甘油和抗坏血酸等单独或联合诱导，可以形成聚集体或结节，碱性磷酸酶活性增高，基质明显钙化，可分化为成骨细胞。一些生长因子如BMP、TGFβ、bFGF等也可以诱导MSCs成骨分化^［5］。对鼠颅骨来源的永生化间质前体细胞株2T3分化的分析表明^［6］，配体与BMP受体IB结合，可导致成骨分化；配体与BMP受体-IA结合，可导致成脂肪分化。可能因为BMPR-IA 或BMPR-IB与BMP受体-II形成复合体之后，激活不同的信号转导途径，引起不同基因的表达。

对于成软骨细胞分化的机制目前尚不清楚，但MSCs在体外培养过程中，可以自动或经诱导分化成为软骨细胞。Fortier等（1998）从马的胸骨骨髓离心得到的MSCs，单层培养，其形态从纺锤状成纤维细胞样外形逐渐变为圆形，形成集落斑，并且经历从I型胶原的表达向II型胶原表达的转变，蛋白聚糖的合成也不断增加，表明来自成年马骨髓的MSCs在单层培养时成软骨分化。Johnstone等（1998）通过单层培养分离得到的兔MSCs，转入试管中形成聚集体，在含10^-7mol/L地塞米松的培养基中培养，经组织染色和免疫组化检测，有II、X型胶原表达，表明诱导成软骨分化；用TGF-β1处理，有或无地塞米松，均可诱导所有细胞进行分化，并伴随聚集体细胞碱性磷酸酶活性的提高。Mackay等（1998）将成人骨髓来源的MSCs在地塞米松和TGF-β3的诱导下，第14天，在细胞外基质中检测到II型胶原、aggrecan；用地塞米松和甲状腺素处理，MSCs可以进一步向肥大软骨细胞分化。另有很多实验证明，将MSCs形成聚集体后，可能有利于成软骨分化，这与体内软骨发育的情形类似。在聚集体内部细胞缺乏血管提供养分，依靠细胞与细胞之间的相互作用，也许是成软骨分化的一个有利条件。

MSCs在体外诱导因素的作用下，也可定向分化形成脂肪细胞和肌细胞。Pittenger等（1999）用1-甲基3-异丁基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素和茚甲新诱导人的MSCs，在细胞内逐渐聚集含脂丰富的小泡，这些细胞表达过氧化物酶体增殖激活受体2（PPAR2）、脂蛋白脂酶（LPL）和脂肪酸结合蛋白αP2。多种诱导处理导致95％以上的细胞定向分化为脂肪细胞，并且脂肪泡不断地长大、融合，最终充满细胞。这些脂肪细胞在体外培养可健康生长至少3个月^［3］。Wakitani等（1995）将大鼠骨髓来源的第二代MSCs在培养皿中经5-氮胞苷处理24小时，7～11天后,在某些培养皿中可以观察到长的多核肌管，也可在细胞的细胞质中观察到苏丹黑阳性小滴。这些观察说明出生后有机体骨髓中的MSCs可以成为肌祖细胞的来源，可为肌肉再生的临床研究提供基础^［7］。

目前，MSCs分化为不同类型细胞的机制尚不清楚，但是对MSCs在体外的分离、扩增和分化的研究，提供了探究细胞定向分化机制的可能。从不同的分化条件分析，基础营养、细胞密度、空间组织、机械力、生长因子对MSCs的分化都有很大的影响。在各种分化培养条件下，MSCs还可以产生对谱系发展十分重要的自分泌和旁分泌因子。

三、MSCs在组织工程和基因治疗上的应用前景

近年来，人们不断地探索利用MSCs进行细胞治疗和基因治疗。只需通过局部麻醉，就可较容易地得到少量骨髓抽取物，而不影响人体的健康；而且将分离的MSCs在体外培养扩<