获奖题目：中枢八肽胆囊收缩素(CCK)的抗阿片作用是决定针刺镇痛和吗啡镇痛有效性的重要因素。主要完成人：韩济生，王晓京，周岩，张立新，刘乃江。获奖等级：国家自然科学二等奖。资助单位：国家自然科学基金委，国家科技部(攀登计划)，美国国立卫生研究院药物成瘾研究所。

随着神经化学和分子生物学技术的进步，有越来越多的神经肽被发现，估计其数量远远超过50种。在狭小的突触间隙中，这些神经肽之间必然会发生频繁的相互作用，其中包括相互加强(协同)和相互拮抗作用，这是神经生物学中一种带有普遍意义的问题。在神经肽领域中，从1975年开始的对阿片肽的研究占有特殊重要的地位，每年文献超过1500篇。我室从宇宙万物对立统一关系的哲学观点出发，在1980年即提出假说，认为脑内很可能存在着阿片肽的对立面——抗阿片肽，并为此而进行探索。到1989年为止，已发现的具有抗阿片作用的肽类物质已有多种，包括胆囊收缩素(CCK)，血管紧张素Ⅱ，ACTH，FMRF等，其中以CCK作用最强，研究最多。关于CCK，当时的情况是：(1)Ito等(1982)首先报告，外源性注射CCK可对抗β-内啡肽引起的镇痛作用，但是，有很多报告反而认为CCK有镇痛作用(Jurna等．1981，Hill等．1987，Hong．1989)。(2)如果外源性注入的CCK确有抗阿片作用，内源性释放的CCK是否也具有抗阿片作用。(3)CCK抗阿片作用的机制是什么?(4)CCK抗阿片作用将在多大程度上发挥作用，即对药理学上的吗啡镇痛和生理学上的针刺镇痛效应是否会发生实质性的影响?这些问题当时都不清楚。

在本工作中我们企图研究阿片肽与其他神经肽之间可能存在的相互拮抗关系，特别集中研究了中枢神经系统中八肽胆囊收缩素(CCK-8）是否具有对抗阿片的作用。在肯定现象的基础上，较系统地研究了CCK-8的抗阿片作用机制，并用CCK-8抗阿片的机制来解释电针镇痛和吗啡镇痛效果的个体差异性，以及长期应用吗啡和长期施加电针时产生的耐受现象。

主要内容如下：

一、CCK-8是目前已知的作用最强的内源性抗阿片肽

1．行为学研究。用辐射热刺激大鼠尾部引起甩尾反射的潜伏期(TFL)作为测痛指标，可以定量地测定注射吗啡或施加电针刺激时产生的镇痛效应。发现在大鼠脑室或脊髓髓鞘内注射极微量CCK-8(1～4pmol)即能剂量依赖地对抗吗啡镇痛^［1］或电针镇痛^［2］。其抗阿片作用的强度较通常认为最有效的阿片受体拮抗剂纳洛酮(6～30nmol)强6000～8000倍。

2．电生理研究。用微电极记录大鼠束旁核痛敏神经元的单位放电，证明CCK-8可对抗电针镇痛，而CCK抗体能翻转电针耐受(Bian等．1993）。由于电生理方法记录痛敏神经元放电是纯粹的感觉神经活动，不涉及甩尾等运动功能的参与，因此其结果具有更强的说服力。

3．应用中枢微量注射方法明确了CCK-8拮抗吗啡镇痛和电针镇痛的作用部位在中脑导水管周围灰质^［3］、杏仁核、伏核^［4］等核团，而这些核团也正是吗啡引起镇痛的主要作用部位。

4．应用放射自显影方法明确了大鼠伏核、杏仁核、中脑导水管周围灰质内的CCK受体属于CCK_B受体（朴素芬等．1993）。

5．应用脊髓蛛网膜下腔微量注射阿片受体激动剂的方法，发现CCK-8抗阿片作用只限于对抗μ-和κ-阿片受体所介导的镇痛作用，而不对抗δ-受体介导的镇痛作用^［5］。

以上5个系列的实验应用行为学、电生理学和形态学方法充分证明，微量的CCK-8可以作用于大鼠脑和脊髓的特定部位，激活CCK_B受体，对抗μ和κ阿片受体介导的镇痛效应。

二、CCK-8抗阿片的生化机制

多种实验结果表明，CCK-8的作用与阿片受体拮抗剂不同，它不是直接阻断阿片受体，而是激活CCK受体，转而通过多种机制削弱了阿片受体激动剂的作用。

1．受体水平的相互作用。首先用³H标记的阿片激动剂埃托啡进行放射受体结合实验，证明CCK-8确能抑制阿片受体的结合力^［6］。进一步的实验又选用μ、δ、κ三种不同类型阿片受体特异性的³H标记配体作深入分析，发现CCK-8对这三种阿片受体的影响各有特色：它使μ受体总数减少(Bmax降低)，使κ受体亲和力降低(Kd值上升)，但不影响δ阿片受体的结合力^［7］。该结果与上述整体实验中观察到的现象^［5］非常一致。CCK-8抑制阿片受体结合力有两种可能：(1)CCK受体与阿片受体直接对话：(2)一种受体通过受体后机制反馈性影响另一种受体。用³H纳洛酮(阿片受体拮抗剂，能与受体结合，但无内在活性)进行的实验结果表明：CCK-8能抑制³H纳洛酮的结合，说明第(1)种可能性肯定是存在的^［17］，虽然第(2)可能性不能排除。

2．膜片钳实验证明同一细胞上两类受体相互作用。用大鼠的中小背根神经元作全细胞膜片钳实验，记录电压门控钙电流，发现μ和κ激动剂降低钙电流的作用可被CCK-8完全翻转，而CCK-8的作用又可被CCK-8拮抗剂取消^［8，9］。说明CCK首先作用于CCK受体，后者进一步抑制了位于同一细胞上的阿片受体。

3.CCK-8使阿片受体与相应的G蛋白脱耦联。应用GTP的长效衍生物GTPγS作为工具药，发现CCK与GTPγS的作用环节很相似，均能使阿片受体与G蛋白脱耦联，而降低其信号转导作用(Zhang等．1993）。

4．胞内第二信使cAMP并不参与CCK-8的抗阿片作用。实验结果表明，阿片使胞内cAMP水平降低的作用并不能被CCK-8翻转，CCK-8本身也不影响神经细胞内cAMP含量（孙素娟等．1993）。

5．胞内第二信使肌醇磷脂(PI)系统可能参与CCK-8抗阿片作用。CCK-8使神经细胞内IP₃的生成增加，但CCK-8剂量过大时反而无效^［10］。整体实验中也可观察到类似的现象。此外，CCK-8的抗阿片作用可被锂盐翻转，也间接证明CCK-8的抗阿片作用是激活PI系统而实现的。

6．阿片降低细胞内游离钙(［Ca^2＋］_i)的作用可被CCK-8翻转。实验从三个方面进行：(1)用大鼠脑组织突触小体作为实验标本，观察到吗啡抑制⁴⁵Ca的摄取，该作用可被低浓度CCK-8(10～100nmol/L)所翻转。(2)用新生鼠分离的脑细胞为标本观察到μ、δ和κ三种阿片受体激动剂均能抑制⁴⁵Ca的摄取。CCK-8可以对抗μ和κ激动剂的作用，但不能对抗δ激动剂的作用^［11］。这与整体实验中所得到的结果^［13］一致。(3)CCK-8本身可使分离的大鼠脑细胞中［Ca^2＋］_i含量显著升高^［11］，这与阿片降低［Ca^2＋］_i的作用恰恰相反。值得注意的是，即使在培养液中无Ca^2＋的情况下，CCK-8仍有升高［Ca^2＋］_i的作用，提示CCK-8主要不是促进外钙内流，而是从细胞内的钙库中释放出游离钙^［11］。这一设想得到另一实验支持，即CCK-8可使胞内第二信使IP₃水平显著升高^［10］，而IP₃的主要功能之一正是从钙库中动员出游离钙，升高［Ca^2＋］_i。

7．阿片降低突触小体钙调蛋白(CaM)而CCK-8使之升高。用大鼠脊髓背半部制备的突触小体(P₂部分)测CaM。发现κ阿片受体激动剂NDAP使CaM含量降低，而CCK-8使之升高，NDAP的作用可被CCK-8大部分翻转，表现出钟型量效曲线（Chen,Han.1994)。

8．PKC可能参与抗阿片机制。CCK-8在使胞内IP₃升高的同时必然也使DAG升高。为了探索DAG-PKC信号转导通路的可能的作用，我们用TPA来模拟DAG，发现给大鼠脑室注射TPA可显著削弱阿片镇痛效应。已知TPA是PKC的强烈激动剂，而PKC可加速外钙内流，这可能是CCK-8增加［Ca^2＋］_i的另一机制(张丽娟．1992)。

三、CCK-8参与吗啡耐受和电针耐受的分子机制

1．中枢CCK-8参与吗啡耐受的证据。给大鼠连续多次注射吗啡，发现脑脊液(CSF)中CCK-8含量显著升高，提示CCK-8的释放加速^［12］。用原位杂交的方法观察到注射吗啡6d内大鼠脑内CCK mRNA逐渐增多，表明CCK的基因表达加速^［13］。应用Northern印迹杂交发现所得的结果与上述原位杂交所得结果完全吻合^［14］。

2．中枢CCK-8参与电针耐受的证据。给大鼠连续电针刺激2h以上，CSF中CCK-8含量显著升高，表明CCK-8释放加速；中脑导水管周围灰质(PAG)中CCK-8的含量升高，表明由CCK前体加工生成CCK-8过程加速。电针8h，脑内CCK mRNA水平急剧上升，表明CCK基因转录速度加快(孙宇华等．1995）。

3．CCK-8抗体翻转吗啡耐受和电针耐受。连续注射吗啡6d引起的吗啡耐受可被脑室或脊髓内注射CCK抗体部分翻转^［15］，连续电针6h引起的电针耐受也可被脑室注射CCK抗血清翻转。

4．CCK受体拮抗剂加强电针镇痛、防止电针耐受。CCK受体拮抗剂能加强高频(100Hz)电针的镇痛作用，对低频(2Hz)电针无加强作用。CCK_A受体拮抗剂devazepide和CCK_B受体拮抗剂L365，260均能加强吗啡镇痛，延缓电针耐受的发生，但CCK_B受体拮抗剂的作用显著强于CCK_A受体拮抗剂的作用。表明CCK的作用主要通过B型受体完成的^［16］