摘要反义药物以其合理设计药物的可能性和精确的特异性广泛吸引了人们的注意，但反义药物的研究并非如人们最初预想的那样简单。 本文从其特异性，稳定性，透过靶细胞的能力，作用强度，活性判定，给药途径，安全性和毒性，生产成本等诸方面对反义药物的研究现状，现存问题进行了综述。相信伴随这些问题的解决，反义药物很可能成为药典的一部分，给疾病的治疗带来益处。

学科分类号Q786；R966

Current Status of Antisense Drugs

LIXue-Jun

（Department of Pharmacology, Beijing Medical University, Beijing 100083）

AbstractThe antisense was first imagined as the therapeutic drug at the end of 1970. After 20 years the antisense drugs have been hitting into the market from laboratory and clinical research. Antisense captures general attention with their promise of rational drug design and exquisite specification. But antisense drugs are far more difficult to produce than were originally anticipated. This article reviewed the current situation and present questions involved in their specificity, stability, potency, toxicology , intracellular delivery, administration routes and costs of manufacture, etc. It is likely that the antisense drugs will be a part of the pharmacopoeia in the future and benefit for treatment of human diseases with the solution of present questions.

Key wordsAntisense oligonucleotides; Antisense drugs; Gene therapy

反义核酸药物即反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide，ODNs ）其核苷酸序列可与靶mRNA或靶DNA互补，抑制或封闭该基因的转录和表达，或诱导RNase H识别并切割mRNA, 使其丧失功能。反义核酸药物是药理学的新领域或革命^［1］， 即：新的药物——反义寡核苷酸；新的药物受体——mRNA；新的受体结合方式——Watson-Crick杂交；新的药物受体结合后反应: （1) RNase H介导的靶RNA 的降解；（2）抑制DNA 的复制和转录及转录后的加工和翻译等。应该说，ODNs治疗比传统的治疗有更高的特异性。从70年代末到现在二十年过去了，反义核酸药物已从实验室研究进入市场。特别是第一个反义核酸药物Fomivirsen上市后，人们对反义疗法更为重视。

ODNs可以作为研究工具，用于对一些特定蛋白和基因的生理功能的研究，也可作为治疗药物用于病毒性疾病、心血管系统疾病、癌症和感染性疾病等许多疾病的治疗。然而，开发这些药物并非易事，首先，消除单个基因的能力还需要进一步的证实，而且一些不期望产生的非反义作用逐渐显现出来。虽然，某些非反义作用也肯定有治疗价值，但由于非反义作用通常是不可预知的，因此，难以以此来合理设计药物^［2］。

目前的研究现状及存在的问题主要有以下几个方面：

一、 ODNs能否以序列依赖的方式调节特异蛋白的功能

反义核酸药物尽管存在一些非特异的作用，但仍能在体内外结合到特异的RNA上，选择性地减少靶基因的产生而产生药理学作用。

为了解决这一问题，科学家通常需要设计多个针对不同RNA区域的ODNs，找出作用较强和选择性较高的ODNs；另外，在设计反义化合物时，注意选择特别易于遭受攻击的靶基因或靶点^［2］；此外，反义ODN的长度也与特异性有关，一般来说， 越长其特异性越高， 大于17个碱基的寡核苷酸与非靶基因杂交的可能性不大，但在体内经过代谢过程可能使链长度缩短，仍有可能与非靶基因结合。目前，反义ODN 的长度多为15～20个碱基，一般可在统计学上保证其特异性。总之，经过认真的选择，设立合适的对照并作出剂量反应曲线，通过大量和仔细的实验，ODNs作为有效的研究工具和治疗药物是可能的。

需要提及的是，理论上靶基因或靶序列在基因组里只出现一次， 但目前还从未证实反义核酸药物具有只敲除一个基因的能力^［3］。

另外，一些ODNs的作用来自于它的非反义作用，这似乎是不利的，但只要该作用有益，而且有高的治疗指数，仍然有临床应用价值。如抗凝血酶的寡核苷酸，就以其非反义机制产生作用，现在该药正在进行临床前的实验。还有另一个非反义寡核苷酸，即整合酶的抑制剂也正作为抗HIV药用于临床实验^［4］。

二、ODNs在体内的稳定性

反义寡核苷酸必须不被内源性核酸酶降解，并被送到靶细胞内才能产生最大的效应。ODNs虽能用病毒载体转入细胞内，但考虑到安全性和临床的应用，促使人们研究和开发非病毒转移系统，即对ODNs作化学修饰和结构改造。

化学修饰可以增加反义ODN 的稳定性。方法主要有：（1)改变立体构型，如由天然的糖苷键改为α型；（2)ODN的磷酸二酯键被甲基、乙基和硫等化学基团取代和修饰；（3)ODN的末端修饰，如连接疏水基团——胆固醇；（4)肽核酸 （peptide nucleic acids ，PNAs)用多肽取代磷酸二酯键，肽核酸在化学上与肽和蛋白质更为接近,是一类非常有希望的基因治疗药物，最近有许多研究进展。开发PNA作为治疗药物在不久的将来可能产生突破，PNA 的反义活性已在培养的神经细胞甚至在大鼠脑内注射后得到证实^［5，6］。

在化学修饰中，硫代磷酸寡核苷酸(phosphorothioate oligodeoxy-nucleotide, PS-ODN)是最为广泛应用的，现在进入临床的所有ODNs几乎都是PS-ODN，称第一代反义药物， 它有良好的溶解性、杂交性和稳定性，并能诱导RNase H。在细胞系的研究中，证实它可以抑制靶mRNA的表达长达24～48小时^［7］。若重复给药或加以其它修饰，则可延长其作用时间。在整体情况下，PS-ODN 的血浆半衰期（T1/2α和 T1/2β)依给药的剂量和动物种属的不同，可以持续数分钟至数小时不等。 其排泄主要通过尿。它的代谢过程比较复杂，但大部分降解产物似乎都是由3'-外切核酸酶产生的。

应用多种化学修饰将更为有益。最近的研究证实，杂合型和嵌合体结构的反义寡核苷酸表现出与PS-ODN 类似的组织分布， 但体内稳定性可明显提高，如T1/2延长。正在研究的第二代反义药物主要是嵌合体结构，以PS-ODN为核心，两翼核苷酸序列上核糖的2'位被其它基团所修饰^［8］, 已显示良好的前景。第二代寡核苷酸的优越之处在于：对核酸酶的抗性增高；其诱导RNase H 酶剪切的活性得到保持和提高；其生物活性与PS-ODN相当，且大大改善了由PS-ODN所造成的毒副作用（主要由于降低了寡核苷酸骨架的多阴离子性质）。

三、ODNs的体内过程及其穿透细胞的能力

反义分子必需能以一定的数量接近靶组织，并穿入细胞膜进入细胞内方能产生作用。

目前对ODNs与血浆成分的相互作用，它在组织中的分布和细胞内的蓄积的机制了解甚少。 PS-ODN iv, ip 和皮下给药后能迅速从血浆分布到除脑以外的外周组织。在肝、肾的蓄积浓度最高。其它组织如肠、脾、皮肤和骨髓也可达到高浓度^［7］。早期（约在给药后2小时）与细胞外成分结合的ODNs和一些细胞内的ODNs可以出现。后期，ODNs可以大量出现在细胞内，如在肾脏的近曲小管上皮细胞内^［9］。

现有的研究结果证实，ODNs是可以进入细胞的，但机制尚不清楚。不同的ODNs进入细胞的方式可能有所不同，在哺乳动物细胞，ODNs可以通过主动过程进入细胞内，如通过受体的介导或通过细胞内吞作用进入细胞内与膜结合的囊胞中，此外也有其它方式。 1992年，Bidker 等从 CHO成纤维细胞（HL60）和其它一些细胞类型的细胞膜上分离到一种80kD的蛋白，该蛋白可以特异的结合PS-ODN。类似的已分离到的受体蛋白还有79kD和90kD等。

不同的ODNs进入细胞的难易程度不同， 硫代磷酸-ODN难于透过细胞膜，在细胞内达到平衡的时间比未修饰的ODNs长，且细胞内的蓄积量也较少。但用脂质体包裹，用低密度脂蛋白，或增加反义药物中的含G量，或用新戊酰羟甲基暂时屏蔽PS-ODN的负电荷等方法均有可能增加ODNs透过细胞的能力。此外，应用抗体、肽、碳水化合物和维生素也可以增加ODNs接近靶细胞的能力^［7］。

另外，我们知道常规应用的ODNs 和肽核酸不易通过血脑屏障(BBB) ，它仅允许分子量＜600 Da的亲脂性分子的通透。 偶联streptavidin (SA) 和转铁蛋白受体 OX26单抗的细胞转移系统可作为通用载体转运单生物素化的肽、ODNs或PNAs到表达转铁蛋白受体的组织。 OX26单抗通过BBB上的转铁蛋白受体的transcytosis转运反义核酸药物进入血脑屏障^［10］。 3'-生物素化的磷酸二酯（PO）-ODN可完全保护ODN抵抗血清和细胞的 3'-核酸外切酶，促进核酸酶H 的偶联和激活，在Alzheimer's 病和HIV-AIDS的模型中，这些转移系统显著增加细胞摄取PO-ODNs并加强其反义效应。 但生物素化的PO-ODNs 和PO-PS-ODN 杂交体易于在体内被核酸内切酶降解。 也有报道在3'-末端生物素化的PS-ODNs在体内代谢稳定,并抵抗核酸外切酶和内切酶的降解，然而由于这些低聚物与血浆蛋白有强的结合，难于转移到脑内。另外由OX26-SA作转移载体的PS-ODNs 也很少能通过静脉给药跨越BBB转运进入脑。 而PNAs不仅抵