摘要为能快速、准确地克隆出有意义的基因，本文介绍了目前常用的一些基因克隆方法，如差异显示PCR、抑制性差减杂交、RAP-PCR、代表性差异显示、酵母双杂交系统、cDNA直接捕捉法等；并对这些方法作了简要的评价，以利于大家选择适合自己的方法。

学科分类号Q785

A Brief Introduction to the Methods for Novel Gene Cloning

SUN Chun-Xiao,Albert C.H.Yu

(Laboratory of Neuronal Injury and Regeneration,Shanghai Research Center of Life Sciences,Chinese Academy of Sciences,Shanghai 200031)

Albert C.H.Yu

(Department of Biology,Hong Kong University of Sciences and Technology,Hong Kong)

AbstractThere are a lot of methods for novel gene cloning,but how to clone candidate gene(s) quickly and correctly? This is a brief introduction to methods of novel gene cloning,these methods includes: differential display reverse transcriptase polymerase chain reaction(DD RT-PCR),suppression subtractive hybridization(SSH),RNA arbitrarily primed PCR(RAP-PCR),representational difference analysis(RDA),yeast two-hybrid system,cDNA capturation,et al.We not only introduced these methods,but also discussed the advantages and disadvantages of them.However,no single method is omnipotent,one should pick up the method most suitable for a special purpose.

Key wordsGene; Cloning; Differential display

人类23对染色体大约含有3×10⁹ bp DNA，其中只有3%～5％ 的基因能表达出有生理意义的蛋白质；这些基因异常扩增、重排、缺失或突变等变化与人类众多疾病的发生发展有着密切关系。如何快速、准确地克隆出这些基因是人类基因组第二个五年计划的首要目标。目前基因克隆的方法多种多样，本文就比较常用的几种方法分别作一简单介绍，这些方法各有利弊，各人应根据自己的需要选择不同的方法，以取得理想的结果。

一、 差异表达基因(片段)的获得

生物体之所以能表现出各种各样的特性，展示出丰富多彩的表型，主要是由于其内部基因表达的差异所致，因此认识生物体内部基因有序地、时相性地表达是揭示遗传信息复杂性的一个极为重要的步骤。基因表达的差异表现为二个方面：一是基因表达种类的不同；二是基因表达水平的改变。如何检测这些差异表达的基因呢？为此，科学家们设计了以下几种主要方法：

（一)差减杂交(subtractive hybridization,SH)与抑制性差减杂交 ( suppression subtractive hybridization，SSH) 差减杂交或消减杂交最早由Lamar 和Palmer于1984年提出^［1］，他们先用超声波打断雌性小鼠的DNA，用Mbo I完全消化雄性小鼠DNA；将两者一起变性、复性 (其中被打断的雌性小鼠DNA过量100倍)，再将产物克隆入表达载体的BamH I位点中，只有那些两端均有GATC序列(即被Mbo I切割并自身复性的基因，也即雄鼠特有的基因)才能被克隆入载体，这样就达到了驱逐两者共有序列的目的，并最后得到了雄鼠Y染色体的DNA。该方法的缺点是技术要求高、耗时、工作量大，并且有时往往不大可行或不可靠。然而经过多年的改进，它已发展成为众多基因克隆方法的基础，许多其它方法均是从该方法衍生发展而来。抑制性差减杂交(SSH)^［2］就是其中的一种。SSH是先将tester(样本) mRNA 和driver(参照) mRNA分别逆转录成cDNA，用4 碱基识别酶 (Rsa I)酶切两种cDNA产生平端片段；tester cDNA分别接上adapter(接头)1和adapter 2，并与过量的经Rsa I消化的driver样本杂交。设计引物于adapter处，使具有差异表达的片段才能成为PCR扩增的模板，重复杂交以减少非特异性扩增片段，利用adapter上的酶切位点进行克隆、测序等。

由于每一mRNA逆转录成的cDNA经Rsa I酶切可产生一个以上的cDNA片段，故SSH的检测率较高、二轮杂交和二轮PCR可大量扩增特异表达片段。但由于二次杂交中driver-cDNA均为过量，tester-cDNA中某些表达丰度有差异的cDNA可能被掩盖，本方法所需的mRNA量较大(达数微克)，稀有样本检测较困难；并且酶切后的cDNA与adapter的连接效率是实验中的关键，连接效率不高就难以发现有表达差异的基因。

(二)差异显示PCR (differential display reverse-transcriptase PCR,DD RT-PCR)本方法由Liang等于1992年报道^［3］，目前该方法在实验室被广泛使用。其主要原理是：利用大多数真核细胞基因mRNAs结尾处有多聚腺苷酸［poly(A)］结构，在其3'端设计象5'-T₁₁CA样引物，该引物可与mRNAs总数的十二分之一(即poly(A)前面二个碱基为TG 的mRNA)结合，从而使这部分基因得到逆转录；而一套(即T₁₁MN，M、N代表4 种碱基中的一种，但M不为T，共有12条) 引物可使全部mRNA得到扩增。由于PCR能扩增的长度 是2～3kb，而mRNA的平均长度只有1.2 kb；故在其5'端再设计一些随意碱基顺序的引物(20 条10-mer)，可以使不同长度的基因得到扩增。如果在PCR扩增时，采用［α-³⁵S］-dATP 代替dATP，在凝胶电泳后的放射自显影照片上就可发现不同长度的PCR产物。针对使用同位素［α-³⁵S］-dATP容易在做PCR时衰减的缺点，Liang 等重新推荐使用［α-³³P］-dATP；针对使用同位素在割胶时易发生差错的缺点，Chen等对方法作修改的同时以DIG代替同位素，取得了不错的效果。

该方法具有简便、灵敏、高效及省时等优点，它能够快速地显示细胞mRNA的组成，可对各样本mRNAs的差异同时进行比较和展示，并且所用的mRNA 量少；可以立即对扩增的cDNAs进行测序和亚克隆及探针标记、杂交、文库筛选等；也有报道认为不宜采用从DD PCR得到的不纯的片段作Northern blot 的探针。它的缺点是假阳性条带多、对低丰度的基因表达不易检测、工作量大、无法定量研究及基因的克隆受mRNA表达时效的影响等。造成假阳性的原因有PCR反应管不好、RNA降解和DNA污染等；而且在电泳胶上的单一条带有可能含有一种以上的cDNA，其中一些可能是差异表达基因，另一些可能是组成表达基因。Vogeli-Lange等将对照RNA和样本RNA最初的DD RT-PCR产物分别与差异克隆逐一杂交，根据杂交类型，将两者分开^［4］。DD RT-PCR还有一个比较大的问题是其扩增出来的条带往往是在基因3'端比较短的一段序列，这部分序列往往在基因的3'UTR区，所提供的信息比较少，为得到cDNA必须进行cDNA文库筛选等费时耗力的工作。

(三)DNA代表性差异分析(DNA representational difference analysis，DNA RDA)代表性差异分析方法有二种：一种是基因组DNA (gDNA)的代表性差异分析(gDNA RDA)；另一种是cDNA的代表性差异分析(cDNA RDA)。前一种方法是由Lisitsyn等于1993年在差减杂交的基础上发明^［5］的。后一种是由Hubank等于1994对前一种方法的改良而来。它们在一定程度上具有差减杂交和DD RT－PCR两者的特点^［6］。

在gDNA RDA 中，先用相对不足的6碱基识别酶对gDNA进行消化，再与寡核苷酸接头连接，用PCR扩增20个循环，只有那些1 kb以下的片段被扩增，这些被扩增的片段称为扩增子(amplicon)（不同的内切酶可产生不同的扩增子）。在检测扩增子(tester amplicon)和驱逐扩增子(driver amplicon)产生之后，再将tester amplicon的5'端与新的adaptor连接并与过量的driver amplicon混合一起变性、复性以去除两者的共有部分(称为消减富集)；加入Taq DNA 多聚酶后，只有那些自身复性的5'端带有接头的双链DNA 3'才能被补平，这样只有这些自身复性的tester片段才能被随后的PCR扩增(称为动力学富集)，而driver amplicon只为与tester amplicon的同源片段竞争复性而存在。重复杂交-扩增步骤可使共有序列最大程度地被去除，剩余的差异表达片段可以被用于克隆和测序。

该方法可以用于新基因的发现、肿瘤中基因的异常和遗传分析等；但由于步骤本身的随机性，消减扩增之后的PCR产物并不一定代表有意义的目的基因,且在样本制备中的污染也可能产生假阳性；此外，我们不清楚什么情况下，某一器官或组织会发生基因重组；也不知道组织中基因嵌合的程度。

cDNA RDA的基本原理与gDNA RDA基本类似，均是通过消减富集和动力学富集而实现。Hunbank等认为gDNA代表性差异分析对样本的处理太复杂，因此他们提出改进：如果先用识别6个碱基的酶对gDNA进行消化，用PCR进行扩增，只有150～1000 bp 的片段可以被扩增；而大部分片段不能被扩增，其代表性片段占总数的2%～10％；而用酶对cDNA消化后PCR扩增的结果其代表性片段只占原先的1%～2％。少量而又充足的序列就不需要再降低其复杂性。而用识别4 个碱基的酶 (Dpn II)消化产生的代表性片段的平均长度是256 bp ，它可以保证每种主要的DNA片段至少有一条代表性片段被扩增。它的主要步骤是：将tester的mRNA逆转录为cDNA，用4 碱基识别酶消化，与R-Bgl-12/24 adapter (linker)连接，PCR 扩增，去除R-adapter，接上J-Bgl-12/24 adapter，与driver amplicons杂交，补平后PCR扩增，将tester 的J-adapter 换成N-adapter，再与driver杂交，再扩增，代表性片段克隆、测序。为了提高cDNA RDA的敏感性，O'Neill等对此作了改进：合成cDNA用的poly(A) mRNA 的量为100～150 ng；用一种特殊的滤<