摘要应用在同一只雄性SD大鼠中，保留原位垂体并在肾囊内植入一异体垂体，同时背部埋植装有17-β-雌二醇（17-β-estradiol,E₂）的药泵，经E₂在体作用60～120天后，其原位垂体和异体移植入肾囊的垂体同时形成垂体催乳素（prolactin,PRL)瘤的动物模型，研究PRL瘤的发病机制。结果表明，E₂长期作用可诱发原位垂体和远离下丘脑的移植垂体同时形成PRL瘤，并伴高PRL血症和PRL基因的高表达；体外和体内实验结果均显示，一些相关生长因子或细胞因子可能与PRL瘤的形成有关；分析正常垂体、原位和移植垂体瘤中PRL基因调控序列的结构，表明在原位垂体瘤中PRL基因近端启动子区发生点突变，突变启动子活性增高，而移植垂体瘤PRL基因相应序列无改变。上述结果提示：垂体PRL瘤可能原发于腺垂体水平，但未排除继发于下丘脑异常的另一可能性；雌激素诱发原位和移植垂体形成PRL瘤的发病机制可能不尽相同；体内神经-内分泌-免疫网络在原位垂体PRL瘤的发生过程可能起一定作用，但其确切证据尚待深入探讨。

学科分类号Q453

Experimental Investigation on the Etiology and Pathogenesis of Pituitary Prolactin-Secreting Tumor

WU Xue-Mei

(Department of Physiology,School of Basic Medicine,Peking Union Medical College & Institute of Basic Medical Sciences,Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100005)

AbstractMale SD rats transplanted with an extra pituitary in the renal capsule and treated chronically with 17-β-estradiol (E₂) were used in the studies on the pathogenesis and the underlying mechanisms of pituitary prolactin-secreting tumor (prolactinoma).The results indicated that after long treatment with E₂,prolactin-secreting tumor was generated in both eutopic and ectopic pituitary,accompanied by hyperprolactinemia and overexpression of PRL gene.No apparent difference was observed in histology and ultrastructure between them.Further investigations showed that some growth factors might be involved in the tumorigenesis of prolactinoma in vivo and in vitro.A point mutation was found in the proximal promoter of PRL gene only in eutopic prolactinoma by polymerase chain reaction-single-strand conformation polymorphism (PCR-SSCP),suggesting that the base change in the promoter may be related to the overexpression of PRL gene.This hypothesis has been confirmed by the increased activity of luciferase reporter fused to the mutant promoter in vitro.The coincidence of overexpression of PRL,TGFα and TGFβ1 gene,and the point mutation detected in eutopic pituitary prolactinoma suggested that neuro-endocrine-immune interactions in vivo might be associated with pituitary prolactinoma formation.The mechanisms mediating tumorigenesis of eutopic and ectopic prolactinoma,respectively,may be different.

Key words17-β-estradiol;Prolactin-secreting tumor;Pituitary transplantation;Growth factor;Point mutation

垂体催乳素（prolactin,PRL）瘤是内分泌系统较常见的疾病，但其病因和发病机制至今尚不完全清楚^［1］。17-β-雌二醇（17-β-estradiol,E₂）在体长期作用于敏感种系大鼠，可以诱致垂体催乳素（prolactin,PRL）瘤的形成，并伴高PRL血症和PRL基因的高表达^［2，3］。这种动物模型已被广泛应用于垂体PRL瘤发生机制的实验研究。本工作根据文献报道的方法并加以改进，在Sprague-Dawley(SD)大鼠的肾囊内植入一异体垂体，同时背部埋植E₂药泵，从整体、组织、细胞和分子水平探讨了垂体PRL瘤的病因和发病机制。由于本实验室从事垂体PRL瘤病因及发病机制的研究已历时近十年，并相继报道了E₂不但能诱致F344大鼠形成垂体PRL瘤，也可诱致SD大鼠形成PRL瘤，这种动物模型伴高PRL血症及PRL基因的高表达；PRL瘤的形成除PRL基因异常表达外，原癌基因c-myc、c-ras也同时呈高表达，提示PRL瘤可能是一种涉及多基因改变的疾病；进一步研究的结果表明，在E₂致PRL瘤形成的分子机制中，PRL基因是“主效基因”；当集中探讨PRL基因高表达调控机制后，曾发现PRL结构基因的低甲基化和DNase I敏感位点增多等表基因机制是PRL基因高表达的部分机制。因此，本工作是在以往系统研究工作的基础上作进一步深入的探讨，虽然难度比较大，但最终获得一些结果。归纳起来有以下四方面进展。

一、垂体PRL瘤原发于腺垂体的可能性

与垂体前叶(腺垂体)分泌的其它激素不同的是，下丘脑对垂体PRL分泌的调节以抑制性为主。因而下丘脑异常所引起的垂体前叶PRL细胞脱抑制，可能导致PRL细胞的异常增殖与分泌，从而形成PRL瘤；另一方面，又有证据表明下丘脑病变并非PRL瘤形成的唯一原因。因此，长期以来有关PRL瘤的发生是继发于下丘脑病变还是原发于腺垂体本身，一直是人们争论的焦点^［4］。

本实验采用雄性幼年SD大鼠（30天龄），保留其原位正常垂体同时在远离下丘脑的肾囊内植入一同胞(sibs)大鼠的异体垂体，经E₂作用60天和120天后，比较了原位和移植垂体在整体、组织、细胞超微结构和PRL基因表达等方面的差异，设假手术组和单纯垂体移植组大鼠为对照组。所得结果：（1）实验60天和120天以后，E₂处理组大鼠的原位垂体和移植于肾囊的异位垂体重量均显著增加，分别达对照组的三倍以上（P＜0.01～0.001）；血浆PRL水平升高达对照组的100～200倍（P＜0.001）；（2）组织学分析表明，原位和移植垂体前叶均表现嫌色细胞增生，嗜酸细胞减少，细胞呈腺瘤样改变；电镜观察可见PRL细胞增生，多形态核，细胞核增大，核仁明显，粗面内质网、高尔基体极度发达，可见异位胞吐现象；（3）取正常垂体前叶细胞、原位和移植垂体瘤细胞进行体外原代培养，以地高辛标记的PRL cDNA探针对培养细胞进行原位杂交，发现原位和移植垂体瘤细胞中PRL mRNA含量均显著高于正常垂体，其中又以原位垂体瘤中PRL基因表达水平最高。

根据Clifton等^［2］的标准，E₂作用60天和120天的原位和移植垂体均符合PRL瘤的诊断标准，表明E₂对远离下丘脑的移植垂体同样具有致瘤作用，且二者在组织形态和细胞超微结构等方面无显著差异。说明PRL瘤有原发于腺垂体的可能性。

二、生长因子对离体垂体前叶细胞增殖和PRL基因表达的影响

对雌激素敏感性乳腺癌的研究表明，生长因子可能是雌激素作用的局部介质^［5］。在某些垂体瘤中生长因子的表达与功能发生改变，提示生长因子可能参与垂体瘤的形成^［6］；虽然已发现垂体前叶表达某些生长因子及其受体，但这些生长因子的作用，特别是对正常垂体前叶细胞的作用尚不清楚。

我们利用激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）扫描和原位杂交等方法，观察了E₂、表皮生长因子（EGF）和转化生长因子β1（TGFβ1）单独或共同作用时,对无血清原代培养的正常大鼠垂体前叶细胞增殖和PRL基因表达的影响，以及不同浓度的E₂对两种转化生长因子TGFα和TGFβ1基因表达的影响。结果表明：（1）10^-8mol/L E₂和10^-8mol/L EGF单独作用均显著促进垂体前叶细胞的增殖，并升高PRL mRNA含量（P＜0.001）；二者共同作用时，上述作用进一步加强；（2）2ng/ml TGFβ1单独作用显著抑制垂体前叶细胞的增殖和降低PRL mRNA水平（P＜0.001）；但与E₂共同作用时其抑制作用明显减弱（P＜0.01），同时E₂的促增殖和促PRL基因表达作用也显著降低（P＜0.01）；（3）10^-8、10^-6mol/L E₂显著升高TGFβ mRNA含量（P＜0.001），同时明显降低TGFβ1基因的表达（P＜0.001），E₂对两种转化生长因子的作用与药物剂量具有一定的相关性。

上述结果提示，E₂体外作用于垂体前叶细胞可升调节刺激性生长因子的作用与表达，同时降调节抑制性生长因子的表达与作用。生长因子可能介导E₂的部分作用。

三、E₂诱发的原位和移植垂体瘤中PRL、TGFα和TGFβ1基因表达的差异

体外实验显示E₂的促增殖和促PRL基因表达作用似乎与垂体局部表达的几种生长因子有关，因而我们进一步采用Northern印迹杂交方法观察了E₂在体长期作用诱发的原位和移植垂体瘤中PRL、TGFα和TGFβ1基因表达的差异。PRL基因表达与前所述原位杂交结果相似，原位垂体瘤和移植垂体瘤细胞中PRL mRNA的含量，经灰度扫描后进行比较，分别为正常垂体细胞中PRL mRNA含量的4.1倍和2.6倍（P＜0.01），但移植垂体瘤中的PRL表达水平仍低于原位垂体瘤（P＜0.05）；同时仅在原位垂体瘤中检测到TGFα和TGFβ1的较高水平表达，而正常垂体和移植垂体瘤中均检测不到这两种转化生长因子的表达。

原位垂体瘤中PRL、TGFα和TGFβ1的一致性高表达，进一步提示了生长因子参与垂体瘤形成的可能性。但体内、体外E<