摘要目的：通过对人肝癌细胞株(SMMC-7721)转染TGF-β₁基因及反义TGF-β₁基因，观察该细胞PAI-1表达的变化。方法：采用电穿孔法进行基因转染，并用Western blot、Northern blot法加以鉴定后，分别应用Western blot及Northern blot观察该细胞表达PAI-1 mRNA的变化。结果：过表达的TGF-β₁细胞克隆PAI-1 mRNA表达均高于对照组，而低表达TGF-β₁者PAI-1 mRNA表达低于对照组。结论：TGF-β₁可能通过上调肝癌细胞PAI-1的表达，在肝癌浸润和转移过程中发挥重要作用。

中图分类号R735.7文献标识码A

文章编号1001-7399(2000)03-0221-03

Expression of PAI-1 on human hepatoma cells transfected by TGF-β₁ gene and antisense-TGF-β₁ vector

Lin WenshengZhang NongZhang SongwenGu Jianxin Guo Muoyi

（Shanghai Medical University, Shanghai200032）

ABSTRACTPurposeTo study the expression of PAI-1 on human hepatoma cells (SMMC7721) transfected by TGF-β₁ gene and antisense-TGF-β₁ vector. MethodsElectroporation for gene transfection, which was confirmed by Western blot and Northern blot; Northern blot and Western blot analysis were used for detecting the expression of PAI-1 on transfectants. ResultsHigher and lower mRNA levels of PAI-1 were observed in SMMC 7721 cells transfected with TGF-β₁ gene and antisense-TGF-β₁ vector, respectively. ConclusionIt is possible that TGF-β₁ is involved in the invasion and metastasis of human hepatoma by upregulating PAI-1 expression.

KEY WORDSliver neoplasms;hepatoma cell line; transforming growth factor beta; plasminogen activator inhibitor;transfection

纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)在肝细胞性肝癌中过表达与肝癌的侵袭行为密切相关^〔1～3〕。同时，大量研究结果表明，转化生长因子-β1(TGF-β₁)具有多种生物学活性，与肿瘤生物学行为密切相关，在肝细胞性肝癌中表达增强^〔4〕。为了研究肝细胞性肝癌中过表达TGF-β₁和PAI-1间是否有内在联系，本实验将TGF-β₁基因和反义TGF-β₁转染SMMC 7721人肝癌细胞株，观察TGF-β₁对该细胞表达PAI-1的影响，以明确TGF-β₁在肝癌发生浸润和转移过程中的作用。

1材料与方法

1.1重组真核表达质粒pcDNA3-TGF-β₁和pcDNA3-ASTGF-β₁的构建质粒转化扩增、提取、酶切和片段回收按文献方法进行^〔5〕。将真核表达质粒pcDNA3(Invitrogen公司)和pSp65 TGF-β₁用EcoRI酶解，分别回收线性pcDNA3载体和TGF-β₁片段，pcDNA3载体用碱性磷酸酶处理后与TGF-β₁ cDNA片段连接形成重组质粒，筛选转录方向正确和相反的重组体分别命名为pcDNA3-TGF-β₁和pcDNA3-ASTGF-β₁。

1.2SMMC 7721细胞的转染和筛选取75%融合的SMMC 7721细胞用胰酶消化，预冷的PBS吹打后转移入离心管中，离心，再加入预冷的PBS洗涤1次，离心，再加预冷PBS 0.8 ml，转移入Cuvettes管(Bio-Rad公司)中，加20 μl pcDNA3-TGF-β或pcDNA3-ASTGF-β₁质粒，冰浴5 min，电击(200V，1 000 μF)，冰浴10 min，转移入培养瓶，加20倍体积的10%血清，RPMI1640培养液(Gibco-BRL公司)。48 h后，改用含400 mg/L G418，10%小牛血清，RPMI1640培养液。14天后克隆形成，挑10个单克隆至24孔板，10天后再由24孔板转移至培养瓶，在37℃ CO₂培养箱中培养。

1.3Western blot鉴定转染SMMC7721细胞TGF-β₁表达亚融合状态的细胞，弃上清，PBS洗2次，加2 ml无血清培养液，48 h后收集上清，离心，上清中加入等量三氯乙酸沉淀，再用0.5 mol/L NaOH溶解沉淀，进行12% SDS-PAGE变性电泳，PVDF膜转移，一抗为兔抗人TGF-β₁多克隆抗体(1∶500，Sant Cruz公司)，二抗为生物素化鼠抗兔IgG(1∶500，华美公司)。

1.4TGF-β₁基因转染的SMMC 7721细胞的鉴定上述经鉴定表达转染TGF-β₁基因(SMMC-TGF)和反义TGF-β₁(SMMC-ASTGF)的SMMC 7721细胞生长至融合时，用Trizol试剂(Gibco-BRL公司)提取细胞总RNA，取40 μg进行1%变性琼脂糖凝胶电泳和膜转移，紫外线Cross-Linkage固定，α-³²P-dATP(Amersham公司)随机引物法标记TGF-β₁，PAI-1 cDNA探针(由本校分子遗传教研室朱运松教授提供)。按常规方法进行Northern blot杂交。

2结果

2.1重组质粒鉴定载体pcDNA3经EcoRI酶切后显示5.4 kb片段，重组质粒pcDNA3-TGF-β₁经EcoRI酶切后显示5.4 kb和1.6 kb两个条带；经KpnI酶切后显示0.6 kb和6.4 kb两个条带，而pcDNA3-ASTGF-β₁经EcoRI酶切后显示5.4 kb、1.6 kb两个条带，经KpnI酶切后显示1.0 kb和6.0 kb两个条带。证明TGF-β₁及反义TGF-β₁基因已被正确地重组到pcDNA3载体中(图1)。

图1重组质粒pcDNA3-TGF-β₁鉴定：①pcDNA3-TGF-β₁质粒EcoRI酶切。②pcDNA3-TGF-β₁质粒Kpnl酶切。③DNA Marker:λDNA(EcoR1+HindⅢ)。④pcDNA3-ASTGF-β₁经EcoRI酶切。⑤pcDNA3-ASTGF-β₁经Kpn I酶切。

2.2TGF-β₁基因和反义TGF-β₁转染SMMC 7721细胞鉴定Western blot结果显示：与对照组(SMMC 7721)相比，转染反义TGF-β₁基因(SMMC-ASTGF)细胞分泌TGF-β₁蛋白被极大地抑制，而转染TGF-β₁基因(SMMC-TGF2、3、4)细胞分泌TGF-β₁蛋白则比对照组高2倍(图2)。Northern blot结果表明：SMMC-TGF2、3、4和SMMC-ASTGF分别表达较多的2.5 kb TGF-β₁ mRNA和反义TGF-β₁ RNA(图3)。

2.3TGF-β₁对SMMC 7721细胞的PAI-1表达的影响Northern blot结果显示：与对照组相比，SMMC-TGF2、3、4细胞表达3.2 kb PAI-1 mRNA明显提高，而SMMC-ASTGF细胞表达3.2 kb PAI-1 mRNA明显减少(图3)。

图2Western blot检测TGF-β₁多肽：①SMMC 7721细胞。②SMMC-TGF1细胞。③SMMC-ASTGF细胞。④SMMC-TGF2细胞。⑤SMMC-TGF3细胞。⑥SMMC-TGF4细胞。

图3Northern blot检测TGF-β₁和PAI-1 mRNA表达：①SMMC 7721。②SMMC 7721细胞转染pcDNA3。③SMMC-TGF2细胞。④SMMC-TGF3细胞。⑤SMMC-TGF4细胞。⑥SMMC-ASTGF细胞。PAI-1为3.2 kb PAI-1 mRNA, TGF为2.5 kb TGF-β₁ RNA, GAPDH为内参照。

3讨论

研究表明，组织型和尿激酶型纤溶酶原激活物(tPA，uPA)介导的纤维蛋白溶解与肿瘤的浸润和转移密切相关，PAI-1作为tPA和uPA的生理抑制剂，通过与tPA和uPA相互作用，参与肿瘤的侵袭性生物学行为^〔7〕。以往研究发现，恶性肿瘤中PAI-1过表达可能与肿瘤增生时的血管生成有关，也有作者认为PAI-1的升高是肿瘤扩散的标志^{〔3，8，9〕}。最近，郑起等在人肝细胞性肝癌和人肝细胞性肝癌裸鼠转移模型中均发现，PAI-1表达明显提高，并证实肝癌过表达PAI-1与其侵袭性和术后复发相关。

文献报道^〔5〕，在人的正常肝脏中TGF-β₁ mRNA和蛋白一般无明显表达，只有在肝发生纤维化或硬化时，部分Ito细胞和间质细胞可表达TGF-β₁ mRNA，而肝细胞则始终不表达TGF-β₁ mRNA和蛋白。然而大量研究证明，肝细胞性肝癌细胞可有明确的TGF-β₁ mRNA和蛋白表达。Shirai等^〔10〕也曾报道肝癌病人血浆中TGF-β₁含量上升，并比肝炎和肝硬化患者更为明显增强。同时Tsai等^〔11〕也观察到肝癌病人的尿中TGF-β₁浓度上升，且上升程度与肝癌大小及分布状态相关。大量实验研究表明，体外培养的肝癌细胞也表达TGF-β₁ mRNA和蛋白，并发现TGF-β₁能诱导一部分人肝癌细胞株(如HepG2,Hep3B,HuH-7细胞等)生长抑制或凋亡；而另一部分人肝癌细胞株(如Hep3B-TR细胞)对TGF-β₁却无反应^〔12〕。但TGF-β₁对肝癌细胞生物学行为的影响及作用机制至今未被阐明。本实验采用转基因技术，建立<