摘要目的：探讨截骨延长区骨愈合的病理学特点和新骨形成规律。方法：取健康兔27只建立胫骨骨延长动物模型，分别于延长的第0、1、3、5、10、15、20、30、40天处死动物，在延长区取材进行病理组织学观察，同时用抗骨形成蛋白（BMP）单抗作免疫组化染色。结果：延长前即出现血肿，延长第1天血肿机化，第3天出现新的血肿，第5天软骨形成和新血肿机化，第15天出现膜内成骨、纤维性成骨和软骨内成骨,第20天延长区大部分被骨性骨痂取代，第30天开始改建。免疫组化染色显示延长区纤维母细胞、骨母细胞和软骨细胞均不同程度表达BMP。结论：延长区存在膜内成骨、纤维性成骨和软骨内成骨3种方式，以软骨内成骨为主；内源性BMP参与了延长区愈合过程。

中图分类号R683；R336文献标识码A文章编号1001-7399(2000)02-0140-04

Pathological observation of osteogenesis of rabbit tibial lengthened-aera by osteotomy and physical distraction

Yang Julun, Fan Guohua, Cai Xuemin, Lin Yueqiu, Liu Darong, Ruan Mo, Xia Zhengwu

Dept of Pathol,

Dept of Osteopathy, Kunming General Hospital of Chengdu Military Command, Kunming650032

ABSTRACT PurposeTo study pathological characteristics of osteogenesis of rabbit tibial lengthened-area.MethodsTwenty-seven rabbits were used to make models of tibial-lengthening by osteotomy and distraction. The rabbits were killed for morphological observation of tibial lengthened-aera.Bone morphogenetic protein(BMP) was detected immunohistochdmically using monoclonal antibody against BMP.Results Haematoma was presented before distraction. On the first day after distraction haemotoma was organized by granulation tissues. New haemetoma was seen on the 3rd day. On the 5th day new haemotoma was organized and cartilage formed. On the 15th day intramembranous ossification, fibrous ossification and endochondral ossification was present. On the 20th day bone callus occupied the majority of lengthened-area. On the 30th day reconstraction of callus began. It was showed different level expression of BMP in fibroblasts, osteoblasts and chondrocytes.Conclusions (1) Intramembtanous ossification, fibrous ossification and endochondral ossification are involved in the process of osteogenesis of lengthened-area and endochondral ossification is a main pattern. (2)Interal BMP takes part in the osteogenesis of lengthened-area.

KEY WORDS bone lengthening;bone regeneration; fracture healing; bone morphogenetic protein; rabbits; disease models, animal

胫骨截骨延长术是80年代初由Monticelli等^〔1〕提出的，是矫正肢体短缩畸形、修复长骨大段骨缺损及矮身材美容增高的有效方法^〔2〕。但在临床实际应用中由于存在延长区骨痂形成不良、愈合时间长等缺点，使该项技术的应用受到一定的限制^〔3〕。因此，研究骨延长区的成骨方式和新骨形成规律对于探讨骨延长区的成骨机制进而寻找促进骨延长区愈合的方法有重要意义。本实验选择日本大耳白兔建立胫骨截骨延长的动物模型，运用X线检查、光镜观察等手段研究延长区骨愈合的过程，并用免疫组化法探讨了延长区内源性骨形成蛋白（BMP）的表达。

1材料与方法

1.1实验动物选择3月龄清洁级日本大耳白兔27只，均为雌性，体重2.1～2.5 kg,平均2.3 kg。精制颗粒饲料笼养，自由饮水。

1.2骨延长模型的制备剃净右后肢毛，以3%戊巴比妥钠经耳缘静脉行全身麻醉。取左侧卧位，在无菌条件下于右侧胫骨中下1/3处作长约1.0 cm的纵行切口，钝性分离胫前肌，纵行切开骨膜并环行剥离，置入直径为0.5 mm的线锯备用。分别在截骨平面上下各1.5 cm及0.5 cm处穿放4组克氏针（直径1.2 mm），安装半环槽式外固定架，拉动线锯横行截断骨干，清创后缝合骨膜，关闭切口，并作无菌敷料包扎。麻醉清醒后归笼饲养。术后第4天开始进行骨延长，具体方法是调节半环架上的螺母，每天调节2次，每次延长1 mm，共延长10天，总延长长度为20 mm。

1.3延长区X线检查术后第3天X线观察截骨端对位对线情况；分别于骨延长的第5、10、15、20、30和40天X线摄片观察骨再生修复过程。

1.4取材与制片分别于骨延长的第0、1、3、5、10、15、20、30、40天各处死3只动物，分离胫骨周围软组织，完整切取延长区新生骨痂，置10%福尔马林溶液中固定，4℃下以5%硝酸脱钙，常规脱水、浸蜡、包埋、切片、HE染色，光镜观察。

1.5免疫组化染色以BMP的单克隆抗体（第四军医大学提供）为第一抗体作免疫组化染色（S-P法），观察延长区骨愈合过程中内源性BMP的表达情况。

2结果

2.1大体观察在10天的延长期内，延长肢长度逐渐增加，延长区增粗，停止延长后则长度不再增加。未延长肢无此变化。延长区骨膜增厚，完整，未见撕裂痕迹。

2.2X线检查所有实验兔术后胫骨对位对线良好，延长过程中截骨端逐渐分离，未发生错位现象。延长第5天截骨端见少量低密度云絮状骨痂影，中央呈明显放射状透光区。第10天两断端骨痂影密度增高，数量增多，放射性透光区清楚。第15天（即停止延长后5天）骨痂影由两端向中央生长，局部骨痂连接。第20天延长区骨痂大部分连接，呈节段性致密疏松现象。第30天骨痂充满延长区，密度增高增粗，骨外膜下可见梭形骨痂包裹。第40天新生骨皮质影开始形成，连接成细线状，骨痂密度高且均匀(图1)。

2.3病理组织学观察骨延长0天（截骨术后第3天）截骨区广泛出血，红细胞充斥于纤维结缔组织之间，挤压纤维结缔组织，形成血肿。血肿内及血肿边缘可见大量坏死细胞碎片。血肿周围结缔组织内散在多个骨碎片，其外形不规则，边缘不整齐，有的骨细胞已变性、坏死甚至消失，表明骨片开始坏死。延长第1天见血肿内及边缘成纤维细胞、毛细血管增生，形成肉芽组织，表明血肿开始机化。新生的肉芽组织疏松，成纤维细胞和毛细血管连接成网状，其间富含粘液样基质，似胚胎期的间充质。延长第3天大部分血肿被肉芽组织取代，但周围结缔组织内又出现新的出血灶。延长第5天肉芽组织内毛细血管减少，成纤维细胞和纤维细胞数量明显增多，并出现较多的网状纤维和部分胶原纤维，使肉芽组织转化为纤维组织。纤维组织沿长轴方向（纵向）排列，其中有软骨细胞形成。新形成的软骨细胞大而圆，胞浆丰富，核小，紧密排列成片块状或岛屿状。纤维组织内仍有死骨片存在。此外可见新的出血灶和血肿机化现象。第10天纤维组织内见多个软骨岛，大小不等，有的相邻软骨岛已融合。仍可见到新鲜出血灶和血肿机化现象。第15天骨膜区及机化区的纤维组织内有骨样组织生成，骨样组织与其周围的纤维组织有移行，表明膜内成骨和纤维性成骨开始（图2，3）。软骨岛内多处出现软骨细胞变性坏死和基质溶解，在该处形成骨样组织，表明软骨内多个骨化中心形成，软骨内成骨开始（图4）。第20天见软骨内成骨和纤维性成骨继续发展，形成的骨小梁交织成网状，骨小梁表面被覆一层骨母细胞。网眼内为纤维组织。新的出血灶已被完全机化成纤维组织。死骨片已溶解并被纤维组织取代。第30天大部分纤维组织和软骨组织已被网状骨小梁组成的骨性骨痂取代，局部区域尚有残存的软骨。骨小梁沿长轴排列，其内胶原纤维增多，骨细胞体积缩小，基质有钙盐沉积，表面的骨母细胞减少，出现多核的破骨细胞，骨小梁之间的网眼内纤维组织坏死形成空腔（早期的骨髓腔），表明新生骨开始改建。第40天骨小梁继续钙化，沿长轴规则排列，网眼内的纤维组织绝大部分消失，有的骨髓腔内出现骨髓组织，另外还见到新的软骨灶和骨化灶。

图1兔胫骨截骨延长第40天X线片所见。延长区已被骨痂连接起来，可见骨皮质影，但骨密度不如正常骨。

图2胫骨延长第15天，机化的肉芽组织直接成骨（纤维性成骨）。HE×200

3胫骨延长第15天，骨外膜部位直接成骨（膜内成骨）。HE×100

4胫骨延长第15天，软骨岛中央出现骨化中心（软骨内成骨）。HE×400

5胫骨延长第10天，纤维母细胞内有BMP表达。HE×400

2.4免疫组化观察骨延长0天，坏死组织和血肿内即呈BMP阳性。第1天和第3天，除血肿和坏死组织外，肉芽组织内也出现BMP。第5天纤维性骨痂及其中的软骨组织富含BMP。第10、15、20天，纤维组织、软骨细胞和软<