分类号R730.2；R392.11文献标识码A

文章编号1001-7399(1999)05-0441-03

在细胞表面和细胞外基质中，存在着一些对葡氨聚糖肝素和硫酸肝素具有高度亲和力的多肽，总称为肝素结合性生长因子(HBGFs)，如血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)等。FGFs是HBGFs中最大的群体，至少包含10个不同的分子。近年来发现一个新的HBGFs家族，其生物学活性类似FGFs，但结构明显不同于FGFs以及其它已知的生长因子。这个家族包含两个成员，即多向因子(pleiotrophin,PTN)和中期因子(midkine,MK)，其相对分子量分别为18×10³、14×10³，相互间保守氨基酸序列的同源性接近50%。PTN和MK最初被描述为在胎儿与新生儿发育过程中的调节因子^〔1〕，后来逐渐发现PTN和MK还参与肿瘤生长和血管生成的调节。MK则可能直接参与肿瘤生长、转移过程，其MK变异体具有较强的肿瘤特异性，有望成为一个新的肿瘤标志物，因此受到较多注意。笔者就MK及其与肿瘤的关系进行文献综述。

1MK的发现及其蛋白质结构

MK基因首先发现于小鼠cDNA文库，采用差异杂交的方法，杂交探针来自于经视黄酸(RA)处理和未经处理的胚胎肿瘤细胞的mRNA。在胚胎性癌(EC)细胞经RA诱导分化的最初48 h，MK表达增高。此外，在小鼠胚胎发生过程中，MK大量表达于妊娠中期(20天妊娠期中的第8～13天)。相比之下，在成年鼠中，仅在肾脏中可测得MK。这一因子是基于其表达于妊娠中期(mid-gestation)和肾脏(kidney)而得名(由两个词组合而成)。与此同时，另一实验室从鸡胚胎中分离出一个非常相似的蛋白质，它分布于早期胚胎组织的基膜中。这一蛋白质命名为RA可诱导的肝素结合性蛋白质，其实是鸡源性MK。

MK是一个分泌性的碱性肝素结合蛋白，见于经RA处理过的分化鼠EC细胞或第11天龄鼠胚胎的培养液中，SDS-PAGE显示为一个明显的分子带，小鼠和鸡分别为15.5×10³和19×10³。分子量预测值(13.2×10³)与凝胶电泳的实际测定值之间的差异来自于高含量碱性氨基酸。从鸡分泌性MK序列N端分离的疏水性信号肽包含21或22个氨基酸，依种属不同而异。该蛋白在不同的物种间是高度保守的，但在物种间的MK却表现出比PTN更多的可变性^〔2〕。然而，在不同物种的MK之间及MK和PTN之间，10个半胱氨酸残基的相对位置是高度保守的。MK与PTN之间的序列相似性和半胱氨酸的保守位置表明两种蛋白有相似的三维结构，并可能有共同受体^〔3〕。

MK主要由两个基团组成，每一基团含有2或3对二硫键。N端基团是细胞外分泌所必需的信号肽，能保护C端免受蛋白水解酶降解。C端基团具有与RA结合、促神经突生长及增强大动脉内皮细胞纤溶酶原激活物活性的作用。

2MK的基因结构

MK基因在不同种属间，即使远如人和非洲爪虫属间，是高度保守的^〔4〕。MK蛋白由4个外显子编码，含有与编码PTN蛋白的4个外显子相同的蛋白基团。然而，MK基因中的内含子小得多，因而基因也小得多(人MK仅为1.5 kb，鼠MK为2 kb)。人MK基因由5个外显子和4个内含子组成，而鼠MK基因则含7个外显子和4个内含子。这种鼠MK基因中外显子和内含子数目的差别归因于第2个到第4个外显子并不被干扰序列所分隔，而是在MK1、MK2和MK3 mRNA的不同剪接过程中充当内含子。在经RA处理的细胞中，MK2是主要的转录物(MK1∶MK2∶MK3=1∶1.5∶2)，并且是唯一对RA反应的MK分子，这很可能与转录增加及MK2 mRNA稳定性增加有关。

人MK基因位于染色体11q11.2，而小鼠MK基因定位于接近Hox 4.2位点的2号染色体上。

3MK基因表达的调节

前已述及，第一个MK cDNA是通过筛选鼠EC细胞株HM-1中RA诱导基因分离而来。Kadomatsu等^〔5〕报道在HM-1细胞经RA诱导分化成成肌细胞后，MK基因表达明显增高。RA诱导MK基因表达也可见于鼠F9和人畸胎瘤NT2/D EC细胞中。与此相反，Nurcomble等未在p19 EC细胞和多能性胚胎干细胞中观察到RA的这种作用，而其他人仅在p19细胞经RA处理后才检测到MK蛋白。这种不同来自于p19细胞亚系间的差异。

最近有人鉴定了RA反应增强子，其位于MK2 mRNA转录起始位点上游900个核苷酸。用MK启动子/CAT报告基因表达系统转染EC、F9和HM-1细胞，48 h后，经RA诱导CAT的活性增强5～10倍。有趣的是，外胚层内膜细胞内源性MK基因表达不受RA影响，也不能对转染MK/CAT表现RA反应活性。突变研究表明，RA反应位于-1006～-794区，该元件具有与位置和方向无关的增强子样特点。关键区域位于-976～-951位置。RA受体异二聚体(mRAR-alpha/mRXR-alpha)与这一关键区域结合，表明RA能直接调节鼠MK基因的转录^〔6，7〕。最近在人MK基因中发现一个类似的DR5型RA反应性结构，位于人和鼠高度保守区(-1000～-1016)^〔8〕。

4MK的生物学活性

MK是具有分化和有丝分裂活性的蛋白。当p19 EC细胞株以0.1～100 ng·ml^-1 MK处理时，可诱导神经元分化，其分化依赖于MK的浓度，MK浓度低于0.01 ng·ml^-1时则未见神经元分化。鸡MK以及细菌、哺乳动物细胞表达的重组人、鼠MK蛋白，对PC12细胞和小鼠或鸡交感神经元的原代神经细胞的神经突有促生长活性。另外，鼠MK蛋白可诱导PC12细胞分化。

然而，与PTN一样，有关MK的有丝分裂活性的实验资料并不一致。鼠及鸡MK蛋白对PC12细胞具有有丝分裂原活性，重组鼠MK蛋白对10T1/2成纤维细胞是弱有丝分裂原，而对经RA处理过的1009EC细胞产生的神经外胚层前体细胞则为强有丝分裂原。另一方面，对更成熟的来源于1009的神经元细胞、3T3成纤维细胞和NRK细胞来说，这种MK蛋白是没有活性的。鸡MK蛋白对牛表皮透明细胞、3T3成纤维细胞、人和牛脐静脉内皮细胞和CC139细胞缺乏有丝分裂原活性。另外，细菌表达的重组人MK蛋白对主动脉内皮细胞和NIH3T3成纤维细胞也缺乏有丝分裂原活性^〔5〕。采用人肾上腺皮质瘤细胞株SW-13表达MK cDNA，并分析瞬时及稳定转染细胞的表型以及分泌蛋白的活性。从这些转染细胞条件培养基分离而来的MK，可促进SW-13细胞集落形成及人脑和脐静脉内皮细胞增殖。再者，在无胸腺裸鼠中，高水平表达MK的SW-13细胞可转化成肿瘤，这表明MK的活性大致与PTN相似，而两者是否享有相同的受体，目前尚不清楚，但现有资料表明其共同活性可通过相同受体来驱动。

MK还具有增强大动脉内皮细胞纤溶酶原激活物活性的作用，其活性基团位于C端的43个氨基酸中。这43个氨基酸是迄今发现的能增强内皮细胞的纤维蛋白溶解作用的最短肽链。

5MK与肿瘤的关系

有研究表明，MK高度表达于Wilm瘤、肾细胞癌、肺癌、神经纤维瘤和胃癌来源的细胞株，而在Burkitt淋巴瘤及T细胞白血病的细胞株中未发现MK mRNA^〔6～10〕。最近，一些实验室综合研究了MK基因在人类肿瘤中的表达^〔9～13〕。他们采用Northern印迹或RT-PCR研究了MK基因在Wilm瘤、神经纤维瘤和肝癌及来自肺、肾、结肠、胰腺癌的异种移植肿瘤中的表达谱。在大多数标本中，MK转录水平明显高于正常对照组织。在70%肿瘤标本中可见MK表达，其中50%为高水平表达。在一些脑肿瘤组织中检测出低水平的MK转录物，而在正常脑组织中不能检出。在大多数乳腺癌标本中发现有MK表达，但是在非肿瘤组织未见表达^〔12〕。再者，MK表达于几乎所有人原发性神经纤维瘤中。此外，结肠癌中MK水平升高可能与肿瘤的分级有关。浸润性膀胱癌患者MK表达水平与预后不良有关^〔12〕。最近，Muramastu等采用ELISA检测血清MK水平，发现50%以上的HCC患者血清MK水平高达0.6～0.8 ng·ml^-1。值得强调的是，在成人正常细胞中MK表达是很有限的，其血清中MK或者不可测得，或者低于0.6 ng·ml^-1，因而这一发现更具临床意义^〔13〕。以上研究表明，MK在临床肿瘤演化过程中可能具有直接作用。检测MK表达水平可能对肿瘤具有诊断、预测价值。

值得注意的是，近来有人发现一种缺少外显子3的MK mRNA变异体(Truncated MK)，其表达具有很高的肿瘤特异性。外显子3编码N端第一个基团及其邻近的氨基酸(Asp26～Gly81)。就是说，这种截短的MK大小仅相当于完整MK的55%。Aridome等采用PCR检测47例胃肠道肿瘤切除标本MK变异体，在所有46例相应非肿瘤组织未检测到MK变异体，而在16例胃癌组织中有12例，13例直肠癌中有8例，9例肝细胞癌中有5例，以及2例食管癌、1例十二直肠乳头癌均见有MK变异体表达。此外，在所有转移淋巴结中均可测得MK变异体，但经血行转移至肝脏的病灶则未能检出。可见，MK变异体的表达可能与肿瘤生成、淋巴道转移有关^〔14〕。Miyashiro等采用RT-PCR检测34例乳腺癌标本，发现在26例乳腺癌组织中有6例表达MK变异体，非肿瘤组织则不表达。用同样方法检测25例直肠癌标本，发现5例表达MK变异体^{〔15，16〕}。尽管各家报道的MK变异体表达阳性率不一，但一致认为其具有高度肿瘤特异性，因而有望成为一个新的肿瘤标志物。

肿瘤细胞通常通过选择性剪切，产生生长因子或抑癌基因产物的变异体，从而在致癌过程中起着关键作用。MK变异体的病理意义尚不明了，其C端基团仍保留完整，因此其蛋白产物还具有部分功能。但是，由于缺少N端信号肽基团序列，必然影响蛋白向细胞外分泌，于是可能会导致细