摘要目的：探讨角化棘皮瘤（keratoacanthoma, KA）在细胞凋亡方面的生物学特点。方法：用末端脱氧核苷酰转移酶（TdT）介导的d-UTP生物素缺口末端标记技术（TUNEL），原位检测20例角化棘皮瘤中凋亡细胞；应用免疫组织化学技术检测皮损部位bax和bcl-2基因产物的表达。结果：KA中80％（16/20）瘤中心出现凋亡细胞。30％（6/20）肿瘤边缘bcl-2呈弱阳性染色。全部病例bax染色阳性。细胞凋亡指数与bax表达强度显著正相关（r=0.680，P=0.001），与bcl-2表达强度显著负相关（r=-0.618，P=0.004）。结论：细胞凋亡为角化棘皮瘤的典型生物学特征，可能在KA的自然消退中发挥重要作用。

分类号R758.53；R392.3文献标识码A

文章编号1001-7399(1999)04-0290-03

Study on the expression of apoptosis、bcl-2 and bax and their relationship in keratoacanthoma

Li Li, Wang Lin, ^△Cheng Niang et al

(Dept of Dermatovenereol， ^△Dept of Pathol, First Affiliated Hospital of West China University of Medical Sciences, Chengdu610041)

ABSTRACTPurposeTo explore the characteristic of apoptosis in keratoacanthoma (KA).Methods In situ method of terminal deoxytransferade (TdT)-mediated dUTP-biotin nick and labelling staining (TUNEL) was used to identify programmed cell death in 20 KAs. These cases also were examined with immunohistochemical technique for the expression of two protooncogenes, bcl-2 and bax, recently recognized to be involved in apoptosis.Results There were 80%(16/20) apoptosis cells in the center of the tumor. Positive staining with bcl-2 antibody appeared in 30%(6/20) of KAs. All cases expressed bax. There was a significant negative correlation between apoptosis index (AI) and the intensity of in situ expression of bcl-2 (r=-0.618，P=0.001), but a significant positive correlation between AI and the intensity of in situ expression of bax (r=0.680，P=0.004). The weak negative correlation was found between the intensity expression of bcl-2 and that of bax but of no statistical significance (r=-0.364，P＞0.05).ConclusionIt is suggested that cell apoptosis be a biologic characteristic of KA and may play an important role in spontaneous regression of KA.

KEY WORDS keratoacanthoma; apoptosis; bcl-2；bax; TUNEL; immunohistochemistry

角化棘皮瘤（keratoacanthoma, KA）是来源于棘细胞的肿瘤。多数皮损在半年内可自行消退。自行消退的机制不明。近年对生长缓慢、有自然消退倾向的肿瘤如鲍温病和基底细胞癌研究提示细胞凋亡可能起一定作用。细胞凋亡在KA中的状况尚未见报道。Fujimmoto等^〔1〕发现凋亡促进基因bax (bcl-2-associated X protein)在KA中表达。为了探讨细胞凋亡是否在其自然消退中发挥作用，作者采用末端脱氧核苷酰转移酶（TdT）介导的d-UTP生物素缺口末端标记技术（TUNEL），检测了KA的细胞凋亡状况。同时观察了与凋亡相关bax和bcl-2基因产物的表达。

1材料与方法

1.1组织标本病例选自我院1990～1998年资料完整的KA共20例，男14例，女6例，年龄48～83岁，平均68岁。病程1～30月，平均8月。单发型14例，多发型（2个以上）6例。按文献^〔2〕方法作组织学分期：增生期6例，成熟期12例，消退期2例（图1～3）。均发生在头面和手背等暴露部位。全部病例取活检前均未接受过特殊治疗。病理切片均经皮肤病理医师再次确诊。石蜡包埋组织标本，行3 μm厚连续切片，1张常规HE染色，2张TUNEL法染色，4张作免疫组化研究。

图1 增生期角化棘皮瘤.HE×25

图2 成熟期角化棘皮瘤.HE×30

图3 消退期角化棘皮瘤.HE×100

1.2方法

1.2.1原位末端标记TUNEL法染色主要步骤按TUNEL原位末端标记试剂盒（In Situ Cell Death Detection Kit, AP Cat No 1684809, Boehringer Mannheim公司）说明进行。NBT/BCIP显色，核固红复染，甘油明胶封片。阳性对照为正常扁桃体组织，空白对照为不加dUTP，只加TdT的组织切片。

1.2.2免疫组化染色采用标准的S-P法。试剂盒购自Zymed公司。bcl-2抗体（Santa Cruze公司）和bax多克隆抗体（Dako公司）工作浓度分别为1∶50和1∶100。载片经APES处理。主要操作步骤：常规脱蜡水化，滴加第一抗体bcl-2或bax，37℃，1 h。滴加生物素标记的二抗，37℃，30 min。滴加三抗（过氧化酶标记的链亲合素），37℃，30 min后DAB显色，苏木素复染封片。以上各步间均用0.01 mol·L^-1 PBS（pH 7.4）洗3次，每次5 min。阳性对照：bcl-2用肺癌转移的淋巴结，bax为正常皮肤；空白对照以PBS代替一抗，余同前。

1.3结果判断（1）TUNEL法：阳性的细胞形态特征包括：核固缩呈圆形或椭圆形深紫蓝色团块；染色质沿核膜形成新月状、半月状或环状，核质内空泡形成。选瘤块中凋亡细胞和凋亡小体数较多的高倍视野5个，每个视野计数100个细胞中凋亡细胞和凋亡小体数，取5个视野的平均值为凋亡指数（Apoptosis index, AI），用半定量表示：凋亡指数＜5％为阴性（-），5％～30％为弱阳性(+)，31％～50％为中度阳性（），＞50％为强阳性（）。（2）免疫组化法：bcl-2阳性反应定位于胞浆，呈黄色或棕黄色颗粒。bax阳性反应为细胞浆内及核膜呈淡黄色或棕黄色。以bcl-2和bax阳性染色强度及(或)阳性细胞数分为四级：阴性（-）：无任何瘤细胞着色；弱阳性(+)：仅有20％以下瘤细胞着色；中度阳性（）：有25％～50％瘤细胞着色；强阳性（）：有50％以上瘤细胞着色。

1.4统计学方法数据采用SPSS软件进行等级相关性分析。

2结果

2.1TUNEL法KA中80％（16/20）患者AI＞5％，其中＋及各1例，14例。80.33％（5/6）增生期KA即有凋亡现象，平均凋亡指数（43.33％）低于成熟KA（67.64％），但无显著性意义（P＞0.05）。凋亡细胞在KA紧邻角栓的肿瘤区呈巢状分布，多数为圆形或椭圆形深紫蓝色团块（图4，5）。

图4 凋亡细胞在KA紧邻角栓的肿瘤区呈巢状分布.TUNEL×150

图5 凋亡细胞为圆形或椭圆形深紫蓝色团块.TUNEL×500

2.2免疫组化法bcl-2：仅有30％（6/20）的病例与正常皮肤交界处的瘤细胞为阳性染色（图6）。远离肿瘤的正常皮肤基底细胞胞浆呈黄色或棕黄色颗粒可作内对照。bax：全部病例呈阳性染色（图7）。染色强度频数分布见表1。

图6 与正常皮肤交界处的瘤细胞胞浆bcl-2呈现黄色或棕黄色颗粒.S-P×750

图7 bax 表达于胞浆、胞膜和核膜呈棕黄色。S-P×200

图8 bcl-2阳性对照呈黄色或棕黄色颗粒。S-P×250

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