摘要目的：研究癌细胞的内质网膜系统与其侵袭性之间的相互关系。方法：应用共焦激光扫描显微技术观察不同侵袭力的人大肠癌细胞CCL 229及CX-1的内质网膜系统，结合流式细胞仪技术测定两者内质网膜系统的荧光强度。结果：两种癌细胞内均存在着立体网络状结构的内质网膜系统，细胞核周围致密，周边逐渐稀疏。高侵袭力的CCL 229细胞的内质网发达，伪足中存在独枝或立体网络状的内质网，而低侵袭力的CX-1细胞的内质网相对不发达，未见伪足样结构。流式细胞仪检测CCL 229细胞的ER的平均荧光强度为1 024±502.97，CX-1细胞的ER的平均荧光强度为462.90±217.18，统计学处理两者差异显著（P＜0.01）。结论：高侵袭力的CCL 229细胞与低侵袭力的CX-1细胞的内质网膜系统形态及数量上均存在差异，可能与内质网合成和侵袭相关之分泌蛋白的功能有关。

分类号R735.3；R319文献标识码A

文章编号1001-7399(1999)04-0324-03

Comparative investigation of endoplasmic reticulum in cancer cells with different invasive ability

Li Yanchun, Wang Yunqing, Song Jindan

(Dept of Mole Bio, Institute of China Medical University, Key Laboratory of Cell Biology of Public Health Ministry, Shenyang110001)

ABSTRACTPurposeTo investigate the relationship between invasiveness and Endoplasmic Reticulum (ER).Methods Confocal laser scanning microscopy and flow cytometry were used to study the morphology and quantity of ER in human colorectal cancer cell lines CCL 229 and CX-1 which are of different in vasiveness.Results There were three-dimentional network-like ER in both CCL 229 and CX-1, which were mainly distributed around nucleus, and became disparse in the periphery of cell. There were more developed ER in CCL 229 than in CX-1. There was the single tubule of ER in spike like pseudopedia, and the comple ER in lambular psudopedia in CCL 229. While these structures were not found in CX-1. The average flurescene intensity of ER of CCL 229 was 1 024±502.97 while that of CX-1 was 462.90±217.18 according to flow cytometry results, which showed a great statistically difference statisic analysis (P＜0.01).Conclusion The results suggest that there are differences in the morphology and quantity of ER betweens CCL 229 and CX-1, and the difference of ER which plays an important role in synthesis of protein relating to invasiveness may play a part in invisiveness.

KEY WORDS colonic neoplasms; rectal neoplasms; neoplasms invasiveness; endoplasmic reticulum; confocal laser scanning microscopy; flow cytometry

侵袭作为癌细胞的主要恶性生物学特性，实质是癌细胞分泌的某些蛋白酶类参与细胞外基质的降解^〔1〕。众所周知，分泌蛋白质的合成及加工是在细胞内质网膜系统（endoplasmic reticulum, ER）进行的。因此，对不同侵袭性癌细胞内质网膜系统的研究对认识癌细胞及其侵袭特性具有重要意义。

共焦激光扫描显微术（confocal laser scanning microscopy, CLSM）具有高分辨力、强敏感性，独特的光学切片能力及三维结构组建功能^〔2〕，是近年发展起来的用于活细胞及立体结构的观察的新技术。流式细胞术（flow cytometry, FCM）是一种对悬液中的单个细胞或细胞器、质点进行快速测量并自动分析的新技术^〔3〕。用内质网的特异荧光染料将其染色，根据荧光强度将内质网量化即可进行统计分析。

为克服光学显微镜、常规电镜技术观察内质网方面的缺陷，本实验首次将CLSM用于不同侵袭力癌细胞ER的观察，并结合FCM检测了两者ER数量的差异，为认识癌细胞的侵袭行为提供依据。

1材料和方法

1.1细胞培养人大肠癌细胞CCL 229及CX-1（美国哈佛大学Dana Farber肿瘤所惠赠）复苏后，于含10％小牛血清的DMEM培养液中，5％CO_２，100％湿度，37℃条件下培养。

1.2细胞活体染色的荧光显微镜及共焦激光扫描显微镜观察根据Terasaki等^〔4〕的方法进行喹啉蓝染色。取对数生长期细胞经胰酶EDTA消化后，调整细胞密度至1×10^８ 个·L^-1，接种于盖玻片上培养。48 h后取细胞，蔗糖-二甲砷酸钠缓冲液（0.1 mol·L^-1 Sucrose; 0.1 mol·L^-1Cacodylate, pH 7.2）漂洗后，喹啉蓝［3，3-dihexyloxacarbocyanine DioC 6(3)， Sigma公司］，染色10 s，漂洗后置于硅胶观察小室中，于OPTONⅢ型万能显微镜下观察记录。选取典型细胞进行共焦激光扫描显微镜（confocal laser scanning microscope BIO-RAD MRC 600 配置OPTONⅢ型万能显微镜）观察，氩离子激光器，GSB滤光块，COMOS下选取典型图片存入微处理器。

1.3流式细胞仪检测

1.3.1内质网含量分析取对数生长期细胞经胰酶-EDTA消化后，离心收集细胞，磷酸缓冲液洗2次，喹啉蓝染色10 s，收集细胞，调整细胞密度至1×10^９个·L^-1，FACSCAN（Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA）流式细胞仪，488 nm激发波长，FL1-H下测定ER的荧光强度。Cellquest软件分析，结果进行t检验。

1.3.2DNA含量分析采用Nicoletti等^〔5〕的方法进行碘化丙啶（propdium iodide, PI, Sigma公司）染色，FACSCAN流式细胞仪，488 nm激发波长，FL2-H下测定DNA荧光强度。Modfit软件分析，结果进行χ^２检验。

2结果

2.1细胞活体染色的荧光显微镜及CLSM观察结果在OPTON镜下见经喹啉蓝染色后的CCL 229细胞呈梭形铺展。梭形尖端伸出许多丝状伪足，核膜深染、核大，周围胞质中有内质网分布。在CLSM下经图像增强、放大及三维重建，可见梭形的CCL 229细胞质内的小管和扁囊相互连结成网络样的内质网的立体结构。细胞核周围内质网较发达，周边内质网分布稀疏，较圆钝的伪足中可见内质网形成网络状结构并伸展到细胞边缘，由逐级放大的图片可以看到随放大倍率的增加，内质网的网络状结构逐渐清晰。经喹啉蓝染色后的CX-1细胞成球形，铺展差，未见伪足样结构，近核区可见网状内质网。CLSM下可见内质网的小管和扁囊相互连结成网络样的立体结构。

2.2流式细胞仪检测ER及DNA含量分析结果

2.2.1ER含量分析结果流式细胞仪FL1-H通道下获得CCL 229细胞及CX-1细胞的ER组方图。CCL 229细胞的ER的平均荧光强度为1 024±502.97，CX-1细胞的ER的平均荧光强度为462.90±217.18，统计学处理两者差异有显著性（P＜0.01）。

2.2.2DNA含量分析结果流式细胞仪FL2-H通道下两种细胞的DNA组方图显示二倍体峰、四倍体峰、二者过渡峰及杂质峰。Modfit分析显示CCL 229细胞的G_0/1、S、G_２M期及杂质相的各时相构成分别为32.67％、11.66％、24.64％和11.98％；CX-1细胞的G_0/1、S、G_２M期及杂质相的各时相构成分别为30.85％、10.80％、24.57％和11.66％。统计学处理二者构成差异无显著性（P＞0.01）。

3讨论

内质网膜系统是细胞质中由膜性小管、小泡或扁囊连接成的网状系统，亦简称为内质网。它的形态特点、数量多少、分布状态与细胞类型、机能状态及分化程度密切相关。人大肠癌细胞系CCL 229及CX-1均为高分化腺癌细胞系，体外侵袭实验证实CCL 229细胞为相对高侵袭力性细胞系，CX-1细胞为相对低侵袭力性细胞系^〔6〕。

观察两种细胞ER的活体染色，可见两种细胞ER的结构与分布特点存在相似性，均由小管和扁囊相互连结成网络样的立体结构，分布以细胞核周围较稠密，细胞周边较稀疏。黄集前等^〔7〕曾经对多种细胞ER进行观察发现ER存在的多态性，其中对大肠癌细胞的观察结果与本观察一致，提示这种相似性与其细胞类型有关。ER的以核周密集、周边稀疏的分布特点可能与其蛋白质合成及运输功能密切相关，也可能与细胞周期的时相有关。

同时在对两种细胞系内质网的观察发现二者形态上又略有差异，CCL 229细胞细长伪足及片状伪足中的内质网结构在CX-1细胞中尚未发现。从光镜结构及常规扫描电镜观察就可发现CCL 229细胞与CX-1细胞的形态差别，CCL 229细胞表面微绒毛发达，向四周伸出许多丝状伪足，CX-1细胞表面较光滑，未见伪足伸出。高进等提出癌细胞在向外侵袭过程中，丝状伪足在侵袭的起始阶段可能发挥主要作用。超微结构研究表明癌细胞的阿米巴样运动、器官表面的粘附及移动均依靠丝状伪足完成。目前普遍认为癌细胞的伪足具有运动、粘附、吸收营养、吞噬及支持作用^〔8〕。与此同时，研究发现许多蛋白酶的分布正是在细胞表面，就细胞水平而言，其伸出伪足的顶端可能是侵袭发生的要害部位，CCL 229细胞伪足内的内质网结<