摘要目的：研究乙型肝炎病毒X基因在肝癌细胞中的表达及其对肝癌细胞凋亡的影响。方法：用分子生物学的方法构建HBVx基因真核表达载体p^CDNA3.1-HBX，用脂质体将真核表达载体p^CDNA3.1-HBX转染入肝癌细胞HCC 9204，G418 500 mg·L^-1筛选，获得稳定表达HBx蛋白的细胞，阿霉素20 μmol·L^-1诱导细胞凋亡。电镜、琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪检测凋亡细胞。结果：20 μmol·L^-1阿霉素可诱导肝癌细胞凋亡，稳定表达HBx蛋白的肝癌细胞凋亡率比未进行基因转染的肝癌细胞凋亡率低。结论：HBx蛋白可抑制阿霉素诱导的肝癌细胞调亡。

分类号R735.7； R394.2文献标识码A

文章编号1001-7399(1999)04-0283-04

Expression of HBVx gene in hepatocellular carcinoma cell and the effect on apoptosis

Guo Shuangping, Wang Wenliang

(Dept of Pathol, The Fourth Military Medical University, Xian710032)

ABSTRACTPurposeTo investigate the expression of HBVx gene in hepatocellular carcinoma cells and the effect of HBx protein (HBx Ag) on hepatocellular carcinoma cell apoptosis.Methods Molecular biological methods were used to construct the eukaryotic expression vector of HBVx gene named p^CDNA3.1-HBX. HBVx gene was transfected into hepatocellular carcinoma cell line HCC 9204 using lipofectamine. The cells which express HBx protein stably were obtained by the selective medium containing 500 mg·L^-1 G418 20 μmol·L^-1 adriamycin was used to induce cell apoptosis. Flow cytometer and other methods were used to detect apoptosis.Results Apoptotic cells were confirmed by electron-microscopy, flow cytometer and other methods. The percentage of apoptotic cells which stably express HBx protein was lower than that of cells which do not express HBx protein.Conclusion HBx protein can inhibit apoptosis of hepatocellular carcinoma cell induced by adriamycin.

KEY WORDS HBx protein (HBx Ag); liver neoplasms; apoptosis; gene expression

肝细胞肝癌（HCC）是最常见的恶性肿瘤之一，每年至少有250 000例HCC被诊断，其发生与乙型肝炎病毒（HBV）密切相关。HBV携带者发生HCC的比例为200∶1，是人类肿瘤已知的最相关的因素之一，特别是HBVx基因及其产物HBx蛋白（HBx Ag）在HBV慢性感染并发展为HCC的过程中发挥重要作用。细胞凋亡是由特定基因调节的程序性死亡，对维持机体的自身稳定性和防止恶性肿瘤的发生是必要的。研究表明，在原发性肝细胞肝癌中存在广泛的细胞凋亡现象，特别是感染HBV的肝脏，提示HBV可能与肝细胞凋亡相关，并在HBV慢性感染以致发展成HCC的过程中起一定的作用。因此，作者对HBVx基因及其产物在肝癌细胞中的表达及其对肝癌细胞凋亡的影响进行了探讨。

1材料与方法

1.1HBVx基因真核表达载体p^CDNA3.1-HBX的构建用PCR法从含HBV全病毒的质粒p^TTHK扩增HBVx基因。PCR引物和Taq DNA聚合酶购自上海生物工程公司，引物序列如下，分别在上游引物和下游引物5端加限制性内切酶Kpn 1和EcoR 1酶切位点。上游引物：5′TCGGTACCATGGCTGCTAGGCTG3；下游引物：5′GAGAATTCATGATTAGGCAGAGGTG3。

PCR循环条件：94℃ 5 min, 59℃ 1 min, 74℃ 1 min，30次循环后，74℃ 10min。PCR产物用低熔点胶回收，与克隆载体p^T7Blue连接，构建成重组体p^T7Blue-HBX，进行序列测定。选择测序结果正确的克隆提取质粒，经EcoR 1和Kpn 1双酶后连接于真核表达载体p^CDNA3.1，构建HBVx基因真核表达载体p^CDNA3.1-HBX。

1.2基因转染及HBVx基因在肝癌细胞HCC 9204中的表达

1.2.1基因转染选择状态良好的对数生长早期肝癌细胞HCC 9204，用脂质体分别将2 μg p^CDNA3.1，p^CDNA3.1-HBX质粒DNA转入肝癌细胞，p^CDNA3.1为载体对照，未进行基因转染的细胞为空白对照。转染后72 h将细胞接种于含500 mg·L^-1 G418的选择性培养基，37℃，5％CO_２，饱和湿度下培养4周，以筛选阳性细胞克隆。

1.2.2HBVx基因在肝癌细胞HCC 9204细胞中的表达（1）用原位杂交法检测HBVx mRNA在肝癌细胞HCC 9204中的表达：从真核表达载体p^CDNA3.1-HBX上用限制性内切酶EcoR 1和Kpn 1切取HBx片段，低熔点胶回收，13％聚乙二醇8000纯化，地高辛标记的随机引物标记，地高辛随机引物标记试剂盒购自德国宝灵曼公司。转染p^CDNA3.1-HBX的第四代肝癌细胞为实验组，未进行基因转染的肝癌细胞为对照组。按常规原位杂交步骤进行。（2）用免疫荧光法检测肝癌细胞中HBx蛋白：以转染p^CDNA3.1-HBX的第四代肝癌细胞为实验组，未进行基因转染的肝癌细胞为阴性对照，按常规免疫荧光法进行。兔抗HBx多克隆抗体由王文亮教授提供，羊抗兔IgG-FITC购自华美公司。

1.3HBx蛋白对肝癌细胞凋亡的影响

1.3.1阿霉素诱导肝癌细胞凋亡参照张晓东的方法^〔1〕，将含20 μmol·L^-1阿霉素的完全培养液4 ml加入转染p^CDNA3.1-HBX的第四代肝癌细胞和未进行基因转染的肝癌细胞，37℃，5％CO_２，饱和湿度下培养3 h后，洗细胞数次，用无药液的完全培养液继续培养6 h的细胞进行下列实验。

1.3.2常规HE染色步骤略。

1.3.3琼脂糖凝胶电泳收集离壁漂浮和贴壁的细胞提取DNA，进行1.8％琼脂糖凝胶电泳，30V，2 h。

1.3.4透射电镜3％戊二醛固定细胞，制备透射电镜标本。

1.3.5流式细胞仪70％乙醇固定细胞，4℃过夜，流式细胞仪分析细胞周期。

2结果

2.1HBVx基因真核表达载体p^CDNA3.1-HBX的构建重组体p^T7Blue-HBX经EcoR 1和Kpn 1双酶切产生480 bp的目的片段，选择一个克隆测序。结果表明，连接于克隆载体的PCR产物为全长的HBVx基因，含起始码和终止码，属于adw 2型。重组体p^T7Blue-HBX经EcoR 1和Kpn 1双酶切，回收HBVx片段，用T4DNA连接酶定向克隆于真核表达载体p^CDNA3.1，构建成HBVx基因真核表达载体p^CDNA3.1-HBX，酶切鉴定正确（图1，2），说明成功构建了HBVx基因真核表达载体。

图1克隆载体p^CDNA3.1-HBX酶切结果

1：未经酶切质粒p^T7Blue-HBX;2，3：BamH 1酶切质粒p^T7Blue-HBX;

4，5：EcoR 1和Kpn 1酶切质粒p^T7Blue-HBX;6：Mark λDNA/HindⅢ

图2HBVx基因真核表达载体p^CDNA3.1-HBX酶切结果

2.2基因转染及HBVx基因在肝癌细胞HCC 9204的表达

2.2.1基因转染将真核表达载体p^CDNA3.1-HBX转染入对数生长早期的HCC 9402细胞，500 mg·L^-1 G418筛选2周，绝大多数细胞死亡，仅少数细胞存活。存活的细胞继续在37℃，5％CO_２，饱和湿度下培养2周，逐渐形成细胞克隆（图3），初步说明基因转染成功。

图3 转染PCDNA 3.1-HBX的肝癌细胞用G418筛选4周后形成的克隆.×100

2.2.2HBVx基因在肝癌细胞HCC 9204的表达（1）原位杂交法检测HBVx mRNA：按常规方法检测转染p^CDNA3.1-HBX的第四代肝癌细胞中HBVx mRNA，未转染的肝癌细胞为阴性对照。在实验组细胞，可见蓝紫色颗粒样物位于细胞质中，细胞核中无阳性信号，对照组细胞胞质和胞核中均无阳性信号（图4）。说明HBVx基因被转入肝癌细胞并转录。（2）免疫荧光法检测HBx蛋白在肝癌细胞中的表达：按常规免疫荧光法检测HBx蛋白在转染HBVx基因的第四代肝癌细胞中的表达，未进行基因转染的细胞为阴性对照。荧光显微镜下观察，可见在实验组细胞胞质和胞核有黄绿色荧光(图5)。对照组细胞无黄绿荧光，说明HBVx基因被转入肝癌细胞并稳定表达HBx蛋白。

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