摘要目的：研究霍奇金病(HD)RS/H细胞的自发凋亡与组织学分型及PCNA表达的关系。方法：对46例HD行TUNEL原位凋亡检测，并做PCNA免疫组化；以8例淋巴结滤泡型反应性增生病为对照。结果：淋巴细胞为主型和结节硬化型HD的RS/H细胞凋亡发生率明显高于混合细胞型和淋巴细胞消减型者(P＜0.005)，PCNA阳性率前者仅略高于后者；全部HD病例RS/H细胞凋亡发生率与PCNA阳性率呈正相关(P＜0.05)。结论：分化好的HD其RS/H细胞较分化差者易于凋亡，这可解释前者RS/H细胞通常数目较少且病人预后较好；各型RS/H细胞的PCNA高表达而核分裂象不多可能是RS/H细胞发生巨细胞化的原因。

中国图书分类号R733；R392.31文献标识码A文章编号1001-7399(1999)02-0132-03

Relationship between apoptosis and expression of PCNA in RS/H cells of Hodgkin＇s disease

Hao MiaowangHuang ZhizhiLiang Yingrui et al

(Dept of Hematol, Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, Xi＇an710038)

ABSTRACTPurposeTo study the relationship between spontaneous apoptosis and both histological subtypes and PCNA expression in RS/H (Reed-Sternberg/Hodgkin) cells of Hodgkin＇s disease (HD).MethodsApoptosis was identified by TUNEL in 46 paraffin-embedded tissues of HD, and expression of PCNA was detected immunohistochemically. Eight cases of reactive hyperplasia (RH) were acted as control.ResultsApoptosis (TUNEL) rates of RS/H cells in lymphocyte predominant (LP) and nodular sclerosing (NS) subtypes were remarkably higher than that in mixed cellular (MC) and lymphocyte depleted (LD) subtypes(P＜0.005). Positive rates of PCNA in RS/H cells of LP and NS subtypes were slightly higher than that of MC and LD subtypes. The apoptosis and PCNA positive rates for RS/H cells of HD were correlated positively in a linear fashion (P＜0.05).ConclusionWell differentiated RS/H cells of HD are more susceptible to apoptosis than poorly differentiated RS/H cells, which gives an explanation of RS/H cells paucity and better prognosis in LP and NS subtypes. Higher expression of PCNA in RS/H cells may be the reason of their giant cell formation.

KEY WORDSHodgkins disease; apoptosis; immunohistochemistry; proliferation cell nuclear antigen; in situ end-labeling

近年来的研究表明，霍奇金病(Hodgkins disease, HD)对化疗及放疗敏感，可能因这些治疗易使RS/H(Reed-Sternberg/Hodgkin)细胞凋亡所致^〔1〕，因此，原位研究HD的自发凋亡具有重要意义。目前国内尚未见有关HD凋亡原位标记研究的报道。我们采用原位TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end-labeling)技术及免疫组化对46例石蜡包埋的HD组织进行原位分析，从细胞的凋亡和增殖两个角度探讨其生物学特性。增殖细胞核抗原(PCNA)是DNA聚合酶δ的附属蛋白，其合成明显与细胞周期有关，因而被作为细胞增殖的指标^〔2〕。我们采用PCNA单抗P10对HD组织进行免疫组化研究，以阐明HD凋亡发生与组织学分型及增殖的关系，为HD的凋亡诱导及预后判断提供依据。

1材料和方法

1.1材料49例HD蜡块取自1989～ 1998年汕头大学医学院病理教研室及第一附属医院和汕头市中心医院病理科，取8例滤泡型淋巴结反应性增生病(RH)作对照。各例均未进行过化疗、放疗或甾体类激素治疗。HD均经HE切片病理确诊，因人为因素PCNA组化染色完全阴性者3例均不纳入分析范围。余下46例HD中，男性32例，女性14例；年龄5～84岁，平均39岁。Bio-11-dUTP、TdT及缓冲液购自上海华美公司，PCNA单抗PC10为Dako公司产品，蛋白酶K为Sigma公司产品，SABC试剂盒购自武汉博士德公司。

1.2方法标本均经10%福尔马林固定，石蜡包埋，4 μm切片，常规HE染色，光镜观察。HD病例按Rye分型标准进行组织学分型；每例在浸润区至少选择5个高倍视野(×400)计数RS/H细胞(按Lukes^〔3〕有关RS/H细胞的划分标准计数，因行组化染色，一些不典型的网状细胞可能会划入此范围)，并求得平均数；计数500个RS/H细胞中核分裂象数，求得百分率，再与PCNA表达百分率比较，得出PCNA与核分裂指数之比。

原位TUNEL法按照Gavrieli^〔4〕方法略加改进，具体操作及对照设立均同文献^〔5〕。胞核呈明显棕色者为凋亡细胞，每张切片至少观察50个有RS/H细胞浸润而无成片坏死的HP，计数凋亡的RS/H细胞和小淋巴细胞(SL)，按公式求得RS/H细胞和SL凋亡发生率。

RS/H细胞或SL凋亡发生率=

PCNA免疫组化SABC染色参照说明书进行，采用微波炉(低档)对切片预处理20 min；核内呈明显棕色者为阳性，选择典型视野（HP）下计数500个RS/H细胞或SL中PCNA阳性细胞数。求得PCNA表达阳性率。

1.3统计学处理采用t检验以及直线回归分析。

2结果

2.1各组织学类型HD的RS/H细胞数根据Rye分型标准，46例HD中，淋巴细胞为主型(LP)7例，平均RS/H细胞为33.6±19.1/HP；结节硬化型(NS)6例，平均RS/H细胞37.0±9.3/HP；混合细胞型(MC)23例(图1)，平均RS/H细胞71.8±51.3/HP；淋巴细胞消减型(LD)11例，平均RS/H细胞148.6±80.9/HP。

图1显示RS/H细胞。HE×1 000

2.2各型RS/H细胞及SL凋亡检测结果(表1)经比较，LP与NS及MC与LD的RS/H细胞凋亡发生率比较无显著性差异(P＞0.05)；而LP与MC和LP与LD凋亡发生率比较，P值分别小于0.005和0.001，差异有高度显著性。凋亡的RS/H细胞阳性信号位于细胞核，呈深棕色，部分细胞可见胞浆亦呈弱阳性，这与片段化之DNA外溢至胞浆有关，核仁多呈阴性。凋亡细胞呈散在分布，HE未见明显核浓缩；未见成片RS/H细胞凋亡(图2)。SL的凋亡呈散在分布，其凋亡发生率除LP亚型外均低于RH，其意义有待研究。另外，在一些RS/H细胞有较高凋亡率的病例，巨噬细胞胞浆亦被染成棕色，此种反应可能是巨噬细胞吞噬了凋亡小体而被标记之故。

表146例HD各型RS/H细胞及SL凋亡检测结果（，/1000)

^*与RH比较，P＜0.05

图2MC亚型HD的RS/H细胞。原位TUNEL×400

2.3PCNA在RS/H细胞及SL中的表达(表2)LP亚型RS/H细胞PCNA表达阳性率与NS、MC、LD亚型比较，P值均小于0.05。其余各组间比较相差不显著。RS/H细胞PCNA阳性信号位于胞核(图3)。

表246例HD RS/H细胞及SL的PCNA

表达阳性率结果（，%)

图3MC亚型HD的RS/H细胞PCNA染色。SABC×400

8例RH淋巴细胞PCNA的表达阳性率，生发中心明显高于其它部位(P＜0.01)，分别为13.8％±2.0%和5.4％±0.6%。RH生发中心细胞PCNA的表达与各亚型HD的RS/H细胞比较，P值均小于0.0005，差异有非常显著性意义。RH生发中心细胞PCNA阳性率与HD之SL比较，相差不显著(P＞0.05)，表明HD的SL处于明显增殖状态。

2.4PCNA表达阳性率与凋亡的相关性46例HD的RS/H细胞凋亡发生率与PCNA阳性百分率直线相关分析：r=0.3052，P＜0.05，呈正相关。

2.5PCNA阳性百分率与核分裂指数的比值各亚型HD之RS/H细胞核分裂指数，LP为3.2％±0.8%；NS为2.6％±1.0%；MC为2.9％±1.2%；LD为2.9％±1.5%。RS/H细胞PCNA阳性率与核分裂指数的比值为21∶1～32∶1，平均26.3∶1；RH生发中心之淋巴细胞该比值为11.5∶1。

3讨论

细胞的凋亡与增殖受基因精细调控，以维持细胞总体数<