摘要：研究自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats, SHR)心脏L-精氨酸/一氧化氮(L-Arg/NO)系统的改变及其与红细胞L-Arg转运的关系。检测12周龄(W)、16W、captopril治疗4周后的16W SHR (SHR+C)及同龄Wistar-Kyoto (WKY)大鼠心脏的L-Arg转运、tNOS活性、NO-2+NO-3和cGMP含量以及红细胞L-Arg转运的改变。结果显示, sHR心室肌组织L-Arg高亲和转运成分的最大转运速率(Vmax)及低亲和转运成分的米氏常数(Km)均明显低于WKY大鼠;但高亲和转运成分的Km值和低亲和转运成分的Vmax则无明显改变; SHR+C组的改变基本同12W组。心肌组织tNOS活性的变化无统计学意义。NO-2+NO-3及cGMP含量则分别较WKY组降低24.6%、19.8%(P＞0.05, p＜0.05, 12W组), 52.5%、60.4%(P＜0.01, P＜0.01, 16W组)和14.8%、23%(P＞0.05, P＜0.05, SHR+C组)。tNOS活性、cGMP含量与LVW/BW呈负相关, r=0.4507, P=0.05(NOS), r=0.6898, P＜0.01 (cGMP)。红细胞L-Arg转运的改变与心脏一致, 且其Vmax与心肌组织高亲和转运成分的Vmax呈正相关, r=0.5606, P=0.01; 与LVW/BW呈负相关, r=-0.6231, P＜0.01。以上结果表明, SHR心室肌组织L-Arg/NO系统活动被抑制,其抑制程度与心肌肥厚程度呈负相关, 红细胞L-Arg转运的改变与心脏L-Arg转运的改变一致。高血压动物会引起或导致心脏、血管、脑、肾等器官L-精氨酸/一氧化氮(L-arginine/nitric oxide, L-Arg/NO)系统失衡,心脏会发生一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)基因表达减少与活性降低, 以及一氧化氮(nitric oxide, nO)、环磷酸鸟苷(cGMP)生成减少[1]。 而且细胞膜物质转运功能亦会发生紊乱, 表现为血管平滑肌细胞、血小板等L-精氨酸(L-arginine, L-Arg)转运系统抑制[2], l-Arg跨膜转运减少。而长期抑制NOS, 减少NO生物合成, 可导致动物高血压、心肌肥厚[3]及心肌细胞Na-K ATPase na+结合位点与底物亲和力降低[4], Na+膜转运功能障碍。红细胞含L-Arg/NO系统[5], 能合成自己的NO, 红细胞膜上存在Y+和Y+L两种类型的阳离子氨基酸转运体[6], l-Arg主要通过Y+转运体的介导跨膜转运, 红细胞Y+转运体的特征与体内其他组织细胞的阳离子氨基酸转运体的特征一致。发生高血压时, 红细胞L-Arg转运的改变如何？与心脏L-Arg/NO系统改变的关系又如何？这些均有待进一步阐明。本工作以自发性高血压大鼠(spontaneuosly hypertensive rat, SHR)为模型, 观察心脏L-Arg/NO系统和红细胞L-Arg转运的改变及两者的关系, 以探讨高血压时红细胞L-Arg转运的意义。

１材料和方法

1.1 动物模型 实验分为4组: (1) SHR 12周龄组 (12W); (2) SHR 16周龄组(16W); (3) 卡托普利治疗组(SHR+C), sHR自12周龄起, 用卡托普利(captopril, 北京曙光制药厂)100 mg/kg bw灌胃, 每日1次, 连续4周; (4) Wistar-Kyoto(WKY)组, 选用16周龄WKY。动物由北京协和医科大学心血管研究所动物科及中国科学院实验动物研究中心提供。所有动物均用2%戊巴比妥钠35 mg／kg bw ip麻醉, 测颈总动脉血压, 抽取颈总动脉血液5 ml, 摘取心脏, 用生理盐水洗净表面血液, 吸干水分, 称重, 计算左心重/体重比。 血液、心脏作以下测定。

1.2 红细胞 3H-L-Arg转运的测定[7] 将颈总动脉血液置于含有10%肝素钠生理盐水的试管中。 4℃、3?000 r/min、离心10 min,弃上清液, 加4倍体积的缓冲液(mmol/L: NaCl 140, KCl 5, D-glucose 5, MOPS 10, pH 7.4)洗涤, 离心,弃上清, 并吸出沉淀上层15%的细胞。 用红细胞缓冲液反复洗涤3次后, 悬浮在改良的Hank′s平衡盐溶液中(mmol/L: CaCl2 1, KCl55.3, KH2PO4 0.45, MgSO4 0.5, NaCl 1.25, Na2HPO4 0.8, NaCO3 4.2, glucose 5.6, eDTA 1, DTT 1)。 将各管红细胞数调至5×107/ml。

红细胞悬液于37℃孵育3 h, 分装于Eppendof管中, 每管1ml(细胞数为4×107/ml)加入L-[2,3-3H]-arginine(3H-L-Arg, 1.5×106 cpm/管), 浓度范围为5~400 μmol/L,再37℃孵育5 min, 置冰浴, 并迅速用冷等渗盐溶液(mmol/L: MgCl2 107, MOPS 10, pH 7.4)冲洗, 加0.1% Triton x-100(V/V)0.5 ml, 并冻融以溶解细胞。加5%三氯醋酸1ml沉淀蛋白质。取上清液10 μl, 用考马斯亮蓝法行蛋白定量,其余上清经微孔抽滤装置(孔径0.45 μm)微孔滤膜抽滤。 在β液闪计数仪(WALLAC 1410, 芬兰)上测量 3H的放射活性。

1.3 心肌组织 3H-L-Arg转运测定 参照文献[8], 每例取心室肌组织约600 mg, 制备1 mm厚组织薄片, 均分为10管。 每管加K-H液1 ml, 于37℃预孵育30 min后加 3H-L-Arg, (浓度范围在0.01~0.2 mmol/L, 37 kBq／μmol, 浓度范围0.5~10 mmol/L, 9.25 kBq／μmol), 终浓度为0.01~10 mmol/L。 37℃孵育1 min后迅速置于冰浴,然后用冷K-H液终止反应并冲洗3次。组织经甲酸消化后, 用考马斯亮蓝法测定蛋白含量; 再取0.2 ml消化液加入闪烁液(含二甲苯 70%, 无水乙醇30%, pPO 0.4%, POPOP 0.03%), 在β-液闪计数仪上测定 3H放射活性(cpm), 同时做非特异转运管。计算组织摄入 3H-L-Arg的量, 以nmol/(mg pr·min)表示。

1.4 心肌组织cGMP、tNOS、NO-2+NO-3含量测定 cGMP含量测定: 取心肌组织约50 mg, 加冷醋酸缓冲液(50 mmol/L, pH4.75) 2 ml, 冰浴匀浆, 以无水乙醇2 ml洗匀浆管, 合并匀浆液, 60℃水浴中吹干, 测定前用300 μl醋酸缓冲液复溶。cGMP测定用放射免疫分析法,按试剂盒说明书进行。以pmol/mg pr表示。cGMP放免试剂盒由上海中医药大学同位素室提供。

tNOS、NO-2+NO-3含量测定: 制备10%组织匀浆, 取0.1 ml用于测定tNOS, 0.5 ml用于测定NO-2+NO-3,测定方法按试剂盒说明书进行, 试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.5 材料 L-[2,3-3H]-arginine 为美国NEN Llfe Science产品, MOPS, Triton X-100,购自美国Sigma公司, 其余试剂为分析纯。

实验结果以x±s表示, 以方差分析, 组间q检验及相关与回归分析方法作统计学处理。

2结果

２.１体重、动脉血压、左室重/体重比

动物体重组间比较无明显差异。SHR的3个组, 动脉血压、左室重/体重比均明显高于WKY组(P＜0.01)。

2.2心室肌组织L-Arg转运的变化

eadie-Hofstee作图显示, 心室肌组织L-Arg转运有高低亲和两种成分。SHR心肌组织的L-Arg高亲和转运体的转运速率下降, 最大转运速率(Vmax)较WKY组降低24.3%(P＜0.05,12W组)和36.4%(P＜0.01, 16W组), 米氏常数(Km)无明显改变。低亲和转运体的Vmax无明显改变, 而Km值则较WKY组降低15.8%(P＞0.05,12W组)和59.6%(P＜0.01, 16W组)。Captopril治疗可提高心室肌组织L-Arg转运能力, 高亲和转运体的Vmax接近WKY组,而低亲和转运体的Km值接近SHR 12W组。

2.3心肌组织tNOS、 NO-2+NO-3, cGMP含量的变化

sHR心肌组织tNOS较WKY大鼠略降低, 但组间比较P＞0.05。NO-2+NO-3含量较WKY组分别降低24.6%(P＞0.05,12W组)和52.5%(P＜0.01, 16W组)。cGMP含量也低于WKY组, 与WKY组比较, 分别下降19.8%(P＜0.05,12W组)和60.4%(P＜0.01, 16W组)。Captopril治疗组的NO-2+NO-3和cGMP含量接近SHR 12W组, 与WKY组相比较,NO-2+NO-3含量仅降低14.8%(P＞0.05), cGMP含量仅降低23%(P＜0.05)。tNOS、NO-2+NO-3、cGMP与LVW/BW之间均存在不同程度的负相关关系,相关系数分别为r=-0.4507, P=0.05 (tNOS); r=-0.368, P＞0.05 (NO-2+NO-3)和r=-0.6898, P＜0.01(cGMP)。

2.4SHR红细胞L-Arg 转运的改变及其与心脏L-Arg 转运的关系

大鼠红细胞L-Arg转运的 Eadie-Hofstee plot呈现单亲和转运方式。与心脏高亲和转运体的表现相似, SHR红细胞L-Arg转运能力较正常血压的WKY组低,其降低幅度与高血压持续时间有关。 在SHR 12W组, Vmax较WKY组低8.7%, 较16W组低30.59%,较卡托普利组低12.2%(均P＜0.01)。红细胞L-Arg转运的Vmax与心脏L-Arg转运高亲和成分的Vmax比较呈正相关, r=0.5606, p=0.01。L-Arg转运的Km值虽略有改变, 但其变化值无统计学意义, 与心脏L-Arg转运的高或低亲和成分的Km值比较均无相关关系。红细胞L-Arg转运的Vmax与LVW/BW之间也呈负相关, r=-0.6231, P＜0.01。

3讨论

细胞膜上转运L-Arg的载体蛋白[9]为Na+-非依赖、pH不敏感的转运体, 主要为Y+型。心肌细胞存在3种阳离子氨基酸相关转运体,分别称为MCAT-1(mouse cationic amino acid transporter-1)、MCAT-2A和MCAT-2B。MCAT-1对底物亲和性高, 对转运刺激敏感, 在生理条件下有基础表达,其特征与Y+表型一致。MCAT-2B为第二种高亲和L-Arg转运体, MCAT-2A为低亲和转运体,此两种转运体仅在细胞受到炎症介质、细胞因子等刺激时才表达[10]。本工作观察到, 大鼠心肌组织L-Arg转运存在高、低亲和两种转运成分,高亲和转运成分的Km值为40.02±7.6 μmol/L, 低亲和成分的Km值为1.004±0.082 mmol/L。 大鼠血浆L-Arg浓度约为50~100μmol/L[11], 以高亲和转运成分为主发挥生物学效应。此结果与文献报道的心肌细胞L-Arg转运体基因表达的结果一致,也与我室以往报道的结果相符[8]。本工作同时观察到, SHR心室肌组织L-Arg转运体高亲和成分的Vmax明显低于正常血压的WKY组,但Km值组间比较无明显差异; 而低亲和成分的Vmax与WKY组接近, Km值则低于WKY组, 提示SHR心室肌组织转运L-Arg的载体与底物的亲和力变化不大,但因载体数量减少, 转运速率减慢; 增加底物浓度, 可提高载体与底物的亲和力, 继而提高转运速率, 使Vmax不致明显下降。本工作还观察到, SHR心室肌组织NO-2+NO-3、cGMP含量低于WKY组。目前已知, L-Arg跨膜转运是经L-Arg/NO途径合成