摘要：用核团或侧脑室微量注射、微电极细胞外单位放电记录及清醒动物胃运动记录等方法, 观察了大鼠下丘脑腹内侧区(ventral medial hypothalamus, VMH)或侧脑室内(icv)微量注入胃动素(motilin)对延髓迷走复合体(dorsal vagal complex, DVC)神经元电活动和胃运动的影响。结果表明: (1) VMH注入胃动素会改变DVC胃相关神经元的电活动; (2) VMH及侧脑室内注入胃动素可使清醒大鼠胃运动增强; (3)膈下迷走神经切断会取消VMH增强胃运动的作用。上述结果提示, 中枢注入的胃动素可能作为促进胃运动的调节因子参与中枢增强胃肠的调控, 下丘脑-延髓-迷走神经可能是实现其作用的通路。胃动素是含有22个氨基酸的多肽, 在外周由胃肠粘膜的内分泌细胞(Mo细胞)分泌, 促进胃肠平滑肌收缩, 消化间期呈周期性释放, 引起胃肠道移行性运动复合波MMC。除消化道外, 胃动素还存在于神经系统, 包括大脑、外周神经和肠壁内神经系统。现已证实脑内含有胃动素神经元及相应受体, 因此, 它也是一种脑肠肽[1]。关于胃动素促进胃肠运动的外周作用与机制, 研究文献较丰富, 但中枢胃动素对消化道运动的调节尚不明了, 下丘脑内胃动素对胃运动的作用与机制也未见报道。

１材料和方法

1．1电生理实验 选用Wistar大鼠(250～350 g) 63只, 雌雄不拘, 自由饮水。 实验前禁食15 h, 20%乌拉坦(1 g/kg)腹腔注射麻醉。作剑突下皮肤切口, 于胃大弯膜部作1 cm切口, 置入薄膜囊, 经聚乙烯软管连至5～10 ml注射器。 实验时注水(3～5 ml, 0.5 ml/s)扩张胃, 作为对胃壁机械感受器的机械刺激。按Paxinos-Watson图谱在下丘脑腹内侧区(ventral medial hypothalamus, VMH)插入套管(坐标: 前囟后2.8 mm;旁开0.4 mm; 颅骨表面下9.8 mm), 以502胶和牙托粉固定外套管。延髓迷走复合体(dorsal vagal complex, DVC)坐标为: 前囟后12.8～13.3 mm, 旁开0.5～1.5 mm, 颅骨表面下7.7～8.2 mm进行玻璃微电极细胞外电活动记录。细胞放电信号经MEZ-8201型微电极放大器及VC-11型双线示波器(日本光电公司)作实时观察及储存, 数据经计算机作非序列密度直方图分析处理。行胃扩张(gastric distension, GD)及VMH微量注射胃动素0.37 nmol/0.5 μl, 观察DVC神经元电活动。胃相关神经元鉴定: (1)神经元自发放电模式及频率相对稳定, 实验项目观察记录完整者计入统计; (2)给予胃扩张刺激后, 放电频率变化超过20%(兴奋型、抑制型反应神经元), GD刺激引起的单位放电有明确“给(on)”或“撤(off)”效应、 并可重复者为GD相关神经元。

1．2清醒大鼠胃运动实验 选用Wistar大鼠(250～350 g) 23只, 雌雄不拘, 自由饮水, 急性手术前禁食15 h, 8%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉, 在距幽门0.5 cm处将应力传感器缝置胃窦浆膜面, 将导线由皮下至后颈部引出。按照Paxinos-Watson图谱, 将套管分别置入侧脑室或双侧VMH。侧脑室坐标: 前囟后0.5 mm， 正中线1.4 mm, 颅骨表面下3.7 mm。以502胶和牙托粉固定外套管, 并以小螺丝钉加固。术后每天经腹腔给予青霉素钠2万单位抗感染, 3 d后动物恢复良好, 即可进行实验。

VMH微量注射(n=9): 双侧核团各微量注射胃动素0.37 nmol或CCK-8 0.043 nmol, 每侧注入0.5 μl; 侧脑室微量注射(n=8): 胃动素0.74 nmol或CCK-8 0.087 nmol, 注入1 μl。观察给予胃动素和CCK-8对胃运动的影响, 并研究膈下切断迷走神经(n=6)对其作用的影响。

胃运动幅度及频率变化率的计算公式：幅度(频率)变化率=

给药后幅度(频率)－给药前幅度(频率)[]给药前幅度(频率)×100%.

1．3药品 胃动素为比利时鲁汶大学胃肠激素研究室Peeters教授馈赠; CCK-8为美国匹兹堡大学Pensula实验室Verbalis教授馈赠。

1．4组织学检查 实验结束后, 经心脏以生理盐水及福尔马林灌流脑部, 快速断头取脑。10%福尔马林内浸泡2 d后,作50 μm系列冠状切片, 观察电极记录位置及脑片内套管轨迹, 不正确者弃去。

1．5统计学检验 结果采用均数±标准误, 均数t检验统计学处理, P＜0.05说明有统计学意义。

2结果

2．1VMH微量注入胃动素对迷走复合体中胃运动相关神经元的影响

2．1．1胃扩张(GD)刺激对大鼠迷走复合体神经元放电的影响 在63只大鼠中, 共记录到98个DVC神经元对GD刺激有反应, GD导致放电频率增加的DVC神经元有59个(59/98, 60.2%), 为GD兴奋性神经元(GD-E), 其放电频率的平均增加百分率为37.12±6.22%, 放电频率由平均15.3±3.38次/s增加至平均最高值22.5±4.41次/s (P＜0.01); GD引起DVC神经元放电频率减少的神经元39个(39/98, 39.8%), 为GD抑制性神经元(GD-I), 其放电频率的平均降低百分率为36.36±3.79%, 放电频率由平均12.1±4.07次/s降低至平均最低值4.0±1.63次/s(P＜0.01)。胃运动相关神经元在接受GD刺激后, 放电频率的增减与其自身放电频率的高低无关(P＞0.05)。

2．1．2VMH注射胃动素对大鼠迷走复合体胃扩张相关神经元放电的影响 实验记录到27个DVC胃扩张相关神经元对VMH注入胃动素的反应。其中, 11个胃扩张抑制反应性神经元中有7个(7/11, 63.6%)呈兴奋反应, 其放电的频率增加率为33.59±9.80% (P＜0.05), 放电频率由平均12.97±4.17次/s升高至平均最高值24.10±7.23次/s, 潜伏期57.6±13.2 s, 持续时间5.15±0.69 min, 其余4个(4/11, 36.4%)无反应; 16个胃扩张兴奋反应性神经元中有4个(4/16, 25%)呈抑制反应, 其放电的频率降低率为27.87±4.43%, 放电频率由平均13.06±5.09次/s降低至平均最低值7.88±4.01次/s (P＜0.01), 潜伏期55.2±31.2 s, 持续时间5.38±2.16 min, 其余12个(12/16, 75%)无反应。

对照组: VMH给予微量注射0.5 μl生理盐水进行对照分析, 13个DVC的胃扩张相关神经元(10个GD-E, 3个GD-I)在VMH微量注射生理盐水, 注射前其放电频率平均为13.92±2.75次/s, 注射后其放电频率平均为13.86±2.84次/s,放电频率变化无统计学意义(图1)。

图1.VMH微量注射胃动素对DVC GD相关神经元放电频率变化率的影响

Fig. 1.Changes in the firing rate of GD-responsive neurons in DVC in response to administration of motilin into VMH (expressed as % of control).

2．2侧脑室及下丘脑腹内侧核注射胃动素或CCK-8对大鼠胃运动的影响

2．2．1侧脑室微量注射胃动素或CCK-8对胃运动的影响 8只大鼠侧脑室内微量注入motilin, 5 min后胃收缩幅度增加百分率为38.17±10.27%,10 min为55.01±15.15%,产生明显的胃运动增强变化(P＜0.05),收缩频率变化无统计学意义; 侧脑室内微量注入CCK-8, 5 min胃收缩幅度变化率为－32.15±4.62%, 收缩频率变化率为－18.30±1.53%, 10 min收缩幅度变化率为－18.05±4.54%, 收缩频率变化率为－5.32±1.80%, 大鼠胃运动明显减弱(P＜0.01～0.05), 与注射生理盐水对照组相比有显著差异(图2)。

图2.侧脑室注射胃动素或CCK-8对清醒大鼠胃运动的影响

Fig. 2.Effects of icv administration of motilin or CCK-8 on the gastric motility in conscious rats.

2．2．2双侧VMH微量注射胃动素或CCK-8对胃运动的影响 在9只大鼠核团内注入胃动素,5 min时胃收缩幅度变化率为27.06±7.85%, 10 min时变化率为37.60±13.83%, 15 min时为57.58±22.85%, 大鼠胃运动增强持续15 min (P＜0.05), 收缩频率变化无统计学意义; 给予CCK-8后, 大鼠胃运动减弱持续5 min (P＜0.05～0.01), 胃收缩幅度变化率为－35.58±7.95%, 收缩频率变化率为-16.47±3.81%, 与注射生理盐水对照组相比有显著差异(图3)。

图3.VMH注射胃动素或CCK-8对清醒大鼠胃运动的影响

Fig. 3.Changes in gastric motility in response to motilin or CCK-8 administration into VMH in conscious rats.

2．2．3膈下迷走神经切断对VMH胃动素增强胃运动效应的影响 切断6只大鼠的膈下迷走神经后重复2.2.2实验, 观察到VMH微量注射胃动素增强胃运动的效应完全被阻断, 胃运动幅度和频率变化率与生理盐水对照组相比无显著差异(P＞0.05,图4)。

图4.切断膈下迷走神经后VMH注射胃动素对大鼠胃运动的影响

Fig. 4.Effect of VMH administration of motilin and NS on gastric motility in vagotomy rats.

3讨论

胃动素在化学结构上与其他肽类无相关性, 没有相同的基因族, 具有较强的种属异源性。胃动素神经元及受体在大脑皮层、小脑皮层内含量最高, 下丘脑内含量中等, 垂体、松果体内有胃动素细胞, 脑脊液和人乳中也有胃动素, 因此提示中枢胃动素能系统可能介导机体多种生理机能[1～3]。

近年, Asakawa等报道, 侧脑室内注入胃动素可增加小鼠摄食量; 侧脑室内注入胃动素对迷宫实验小鼠有抗焦虑作用, 以上作用皆可被胃动素受体阻断剂EM-109消除。由此认为, 胃动素可能作为中枢神经递质或调质参与摄食、焦虑等行为及情绪的整合作用[4,5]。

我们先前的工作曾观察到, 杏仁核内微量注射胃动素可增强胃运动, 而迷走神经切断可消除其作用[6], 提示在边缘系统杏仁核内胃动素可能是中枢促进胃运动的调控因素之一。

下丘脑是调节胃运动、控制摄食的皮质下中枢,