摘要：在大鼠肢体缺血模型上观察了质粒pcDNA3对缺血骨骼肌肌浆网(SR) Ca2+转运的影响。结果显示, 骨骼肌缺血时SR ca2+转运(Ca2+摄入与释放)较非缺血肌肉增强, 而质粒pcDNA3与SR上DNA结合蛋白结合之后, 可进一步增强缺血骨骼肌SR ca2+摄入(P＜0.01)及释放速率 (P＜0.05)。提示质粒DNA对正常及缺血大鼠骨骼肌的SR Ca2+转运能力均有影响,其临床病理生理意义值得进一步研究。DNA结合蛋白不仅存在于细胞核内, Hagstrom及本实验室分别在家兔及大鼠发现骨骼肌肌浆网(sarcoplasmic reticulum, sR)膜上也存在DNA结合蛋白［1, 2］。非核DNA结合蛋白的生理意义尚不清楚,尤其是基因治疗时的病理生理意义目前尚未见报道。我们观察到质粒DNA与SR上DNA结合蛋白结合之后, 明显影响SR功能, 促进SR Ca2+转运,即Ca2+摄入与释放均增加［3］。本实验进一步在大鼠肢体缺血模型上观察了质粒pcDNA3对缺血骨骼肌SR Ca2+转运的影响,以进一步了解病理情况下SR上DNA结合蛋白对SR功能的影响。

1材料和方法

1.1动物及试剂雄性SD大鼠(150～250g, bw)由北京医科大学动物部提供; ～45CaCl2购自Amersham公司, caffeine购自Sigma公司, 其余均为国产及进口分析纯试剂。

1.2大鼠肢体缺血模型制备［4］ 大鼠用3％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后, 用止血带结扎右侧后肢根部, 造成右后肢缺血, 2 h后处死动物,迅速摘取缺血肢体和对侧(左侧)非缺血肢体(作为对照)肌肉, 放于冰冷的生理盐水中, 用以分离SR囊泡。

1.3骨骼肌肌浆网膜囊泡制备［5, 6］将所取肌肉于冰浴中剪碎, 加入7.5倍体积的缓冲液A(w/v)。 缓冲液A(mmol/L): 焦磷酸钠 20,磷酸缓冲液 20, MgCl2 1, 蔗糖 0.303, EDTA 0.5, aprotinin 76.8×10-2, leupeptin 1.1×10-6和PMSF0.23。4℃差速离心10?000 r/min,15 min; 16?000 r/min,30 min; 30?000 r/min,30 min。沉淀即为SR膜囊泡粗提物, 用缓冲液B复溶, 缓冲液B中含20 mmol/L Tris-maleate, 0.1 mmol/L PMSF和0.303 mol/L蔗糖, pH7.0, 应用文献［6］方法分别测定肌肉匀浆及SR膜制备的Ca2+-ATPase (肌浆网标志酶), Na+-K+-ATPase(质膜标志酶) 及azide-ATPase(线粒体标志酶)的活性, 以鉴定SR制备的纯度。用考马斯亮蓝法进行蛋白定量, 并贮存于-80℃备用。

1.4质粒DNA的制备质粒pcDNA3(invitrogen公司), 经转化大肠杆菌进行扩增, 应用聚乙二醇纯化, 获得闭合环状DNA,于-20℃贮存备用。

1.5大鼠骨骼肌肌浆网Ca2+摄取功能测定参照Ortega等［7］报道的方法测定SR Ca2+摄入, 反应体系每管200 μl, 反应混合液组成(mmol/L): kCl 100, MgCl2 5, CaCl2 0.05, HEPES 10, pH 7.1, 含200g SR蛋白, 37kBq ～45CaCl2。加入5 mmol/L Ca2-ATP, 37℃启动Ca2+摄取反应, 反应时间30min, 经微孔滤膜抽滤后液闪仪测定～45Ca2+放射强度。实验分为4组:正常对照组, 对照pcDNA3组, 缺血组及缺血pcDNA3组。质粒DNA处理组预先将缺血及对照SR膜囊泡(200 μg)与20 μg pcDNA3室温共同孵育30 min后, 离心弃上清以去除游离pcDNA3, 沉淀以反应混合液复溶, 再测定SRCa2+摄入。

1.6大鼠骨骼肌肌浆网Ca2+释放功能测定［7］大鼠骨骼肌SR主动负载～45Ca2+反应体系及反应过程同上, 37℃孵育30 min后, 离心12?000 r/min, 5 min, 弃上清, 沉淀洗涤后, 每管加入400 μl释放液(mmol/L: KCl 80, Tris-HCl 20, pH 6.8, caffeine 10), 并分别于1、3和5 min各取100 μl, 测定～45Ca2+放射活性。实验分组及质粒DNA处理同上。

1.7统计学处理所有数据均用x±s表示, ANOVA方差分析, 组间q检验, P＜0.05为差异具有显著性。

2结果

2.1大鼠骨骼肌肌浆网纯度鉴定

SR膜Ca2+-ATPase的活性较骨骼肌组织匀浆高6.5倍［nmol/(mg.min)］: 30?038 vs 4014, P＜0.01), na+-K+-ATPase及azide-ATPase的活性较骨骼肌组织匀浆分别低22.2%(P＞0.05)和51.3%(P＜0.05)［nmol/(mg.min)］:143 vs 186; 5?614 vs 11?521。提示制备的SR膜纯度较高。

2.2质粒pcDNA3对大鼠缺血骨骼肌肌浆网Ca2+摄入的作用

用pcDNA3处理后SR Ca2+摄入量较正常对照组升高52%(P＜0.01); 缺血2 h后骨骼肌SR Ca2+摄入量较正常对照组升高(P＜0.05),应用pcDNA3与缺血骨骼肌SR共同孵育后, SR ca2+摄入量较未经pcDNA3处理的缺血组升高16%(P＜0.01)。提示质粒pcDNA3预处理可增强缺血骨骼肌SR Ca2+摄入,但增加幅度较其对正常非缺血骨骼肌略低(见图1)。

图1.质粒pcDNA3对正常及缺血大鼠骨骼肌肌浆网钙摄入的作用

fig.1.Effect of pcDNA3 on calcium uptake of normal and ischemic sarcoplasmic reticulum in rat skeletal muscle. Data are expressed as mean±SD, n=5 in each group. **P＜0.01 compared with control;##P＜0.01 compared with ischemia. (ANOVA followed by q test).

2.3质粒pcDNA3对大鼠缺血骨骼肌肌浆网Ca2+释放的作用

正常对照组大鼠骨骼肌SR Ca2+释放量在1、3和5 min分别为0.40±0.03, 0.61±0.01和0.76±0.02 nmol/mg, 1和3 min的释放量分别为总量的53±5%和80±3%, 5 min时几乎完全释放。应用pcDNA3处理之后, SR Ca2+释放量较对照组明显升高,且释放速率也明显加快, 1和3 min的释放量分别较对照组升高14％和15％(均P＜0.01)。缺血后骨骼肌SR Ca2+释放量较非缺血对照组相应升高,释放速率亦明显加快, 1和3 min的释放量分别为66±5%和89±3%, 与对照组相比差异具有高度显著性(均P＜0.01);应用pcDNA3与缺血骨骼肌SR预孵育后, SR Ca2+释放量与缺血对照组相比明显升高, 释放速率也明显增强, 1和3 min SR ca2+释放速率分别较缺血对照均升高7％(均P＜0.05)。提示缺血骨骼肌SR应用pcDNA3处理后其Ca2+释放速率较缺血对照组明显增强,但增强幅度较正常对照组低(图2)。

图2.质粒pcDNA3对正常及缺血大鼠骨骼肌肌浆网钙释放的作用

fig.2.Effect of plasmid pcDNA3 on calcium release of SR in normal and ischemic rat skeletal muscle. Data are expressed as mean±SD, n=5 in each group. **P＜0.01 compared with control; ##P＜0.01 compared with ischemia. (ANOVA followed by q test).

3讨论

Hagstrom等首次报道, 家兔骨骼肌SR上存在DNA结合蛋白, 分子量为95、 60和28 kDa, 它们可与双链DNA特异性结合［ 1］;本实验室发现大鼠骨骼肌SR 上也存在DNA结合蛋白, 分子量分别为83和58 kD［2］。SR上存在的这些DNA结合蛋白的生物学意义目前尚不清楚。我们以前的研究表明, 质粒DNA与SR上DNA结合蛋白结合之后可以明显促进SR ca2+摄入及释放, 即turnover加快［3］。

本实验进一步证实, 质粒DNA与缺血骨骼肌SR上DNA结合蛋白结合之后其促进SR Ca2+摄入及释放能力的作用依然存在,提示质粒DNA可以影响正常及病理(缺血)条件下SR Ca2+转运, 同时也说明质粒DNA对正常大鼠骨骼肌SR ca2+转运能力的增强作用同样也可见于缺血骨骼肌SR。 两者相比较, 质粒DNA对于正常大鼠骨骼肌SR ca2+摄入及释放能力的增强作用较其对缺血骨骼肌SR的作用强, 提示缺血骨骼肌SR对质粒DNA的反应性降低。

骨骼肌SR的主要功能为参与肌肉兴奋收缩耦联并维持肌细胞胞浆Ca2+稳态, 其中起关键作用的环节即是SR对Ca2+的主动摄取与被动释放,肌浆网对Ca2+的摄取主要依赖其膜上的Ca2+-ATPase的作用; SR钙池释放Ca2+则主要与SR上存在的一种特定的Ca2+释放通道ryanodine受体有关。本实验发现，骨骼肌缺血之后SR ca2+摄入及释放能力均较正常对照组明显增强, 据文献报道这与缺血造成骨骼肌SR Ca2+-ATPase的活性增强以及ryanodine受体的结合特性被改变有关［4,8］。质粒DNA对缺血骨骼肌SR ca2+摄入及释放能力增强作用的机制尚不清楚。本室最近的实验证实, 质粒DNA对正常大鼠骨骼肌SR Ca2+摄入及释放能力的增强作用是通过其增强SR ca2+-ATPase的活性以及改变SR钙释放通道ryanodine受体的结合特性所致［9］, 质粒DNA对缺血骨骼肌SR ca2+转运的作用可能也是通过这些机制实现的。 本实验在观察到缺血骨骼肌SR较正常骨骼肌SR Ca2+转运增强的基础上,发现SR上DNA结合蛋白结合DNA后其Ca2+转运进一步增强, 推测其机制亦可能是在缺血骨骼肌Ca2+-ATP和ryanodine受体激活基础上, sR上DNA结合蛋白结合DNA后其活性被进一步激活, 其确切机制尚需进一步证实。

本文结果显示, 质粒DNA与SR上DNA结合蛋白结合之后不仅可以影响正常骨骼肌SR功能, 而且也可影响病理条件下(缺血)SR Ca2+转运,这些发现的生物学意义尚不清楚。骨骼肌因其容量大, 血流量丰富等优势被作为直接基因转移并进行基因治疗的主要靶器官, 例如转血管内皮生长因子(VEGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)基因促进血管新生治疗肢体血管闭塞性疾病已经进入Ⅱ期临床并取得较好疗效。但是有关DNA转移入细胞后对细胞功能和代谢的影响所知甚少。本实验结果提示,基因转移入骨骼肌细胞之后除了表达目的基因之外, 尚可影响正常及病理条件下SR功能, 其生理及病理生理意义值得高度重视。