摘要：支气管上皮细胞(BECs)的抗氧化活性对于改善上皮的抗损伤能力、维持上皮结构和功能的完整性具有重要意义。BEC表达的整合素分子是细胞外基质成分如纤维连接蛋白(Fn)的受体,与细胞的生长、分化、代谢调控有关。为论证整合素-配体结合反应对细胞抗氧化活性的影响, 本实验用臭氧攻击培养的兔BEC, 观察用Fn或其特异性识别域片段RGD肽处理后细胞内谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(catalase)三种抗氧化酶活性变化和谷胱甘肽(GSH)含量的变化。结果: (1) Fn及RGD肽均呈剂量依赖性地提高GSH-Px活性(分别为r=0.93和r=0.73), fn的上调作用可被钙调素抑制剂W7逆转; (2) Fn可提高SOD活性, 但能被W7阻断; (3) Fn增加细胞的catalase活性, W7可取消这一效应;(4) Fn和RGD肽处理增加细胞内GSH含量, 且有量-效关系(相关系数r分别为0.82和0.84)。以上结果提示,细胞外基质与整合素结合可增强细胞的抗氧化酶活性, 增加GSH含量, 以及提高抗氧化损伤能力。气道上皮经常受到吸入性有害因子的攻击, 而多数损伤因子致细胞损伤的共同下游机制与诱导活性氧生成及脂质过氧化有关系, 导致上皮细胞的脱落,产生气道高反应性疾病。因此, 气道上皮细胞内存在的抗氧化系统是气道上皮自稳态维持的重要基础。 气道上皮细胞表达的整合素(integrin)分子是胶原、纤维连接蛋白(fibronectin, Fn)、 层粘连蛋白(laminin)、 纤维蛋白原(fibrinogen)等细胞外基质成分的受体, 识别基质分子中的Arg-Gly-Asp结构域(RGD肽)与细胞的生长、 分化、 迁移、 代谢等调控有关, 并参与气道上皮的损伤修复[1]。 整合素与基质成分的反应是否也影响气道上皮细胞的抗氧化系统？为论证这一假设,本研究用整合素的配体分子Fn及人工合成的RGD肽处理原代培养的兔支气管上皮细胞(bronchial epithelial cells, BECs),测定细胞内谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)、 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, sOD)、 过氧化氢酶(catalase)活性及还原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)的含量, 观察整合素-配体反应对细胞抗氧化能力的影响。

１材料和方法

1.1主要试剂和仪器RPMI 1640培养基是日本产品, 青霉素、 链霉素均为国产, W7(钙调素抑制剂)、 纤维连接蛋白(Fn)及GSH标准品均为Sigma产品, RGD肽由湖南师范大学生命科学院生化室合成; GSH-Px和SOD测定试剂盒为南京建成生化试剂公司产品; 荧光分光光度计由上海分析仪器厂生产,超声粉碎匀浆器由宁波新芝科器研究所生产。

1.2BECs的分离和培养[2]新西兰兔(1.5±0.3 kg), 雌雄不拘, 动脉放血处死。 取出气管及支气管, 去除结缔组织, 纵行剪开气管和支气管,在0.05%胰蛋白酶中37℃温和消化1 h, 血清终止反应后用乳胶刷刷洗腔面, 收集BECs, 悬浮于4℃的无钙Hanks液中, 1?000 r/min×10 min离心、 洗涤3次。 台盼蓝排斥法计数细胞成活率为82±9%, Gimsa染色上皮细胞纯度为95±4%。 用含青霉素(100 U/ml)、 链霉素(100 u/ml)的RPMI1640培养液混悬细胞(2×106 cell/ml), 于37℃、 5% CO2中培养。

1.3GSH-Px及SOD活性测定按实验分组, 用不同浓度的Fn或RGD处理BECs 2 h; 离心, 弃上清, 用0.05 mol/L的PBS悬浮;经超声粉碎细胞, 3?000 r/min离心15 min, 取上清制成BECs匀浆。 分别按GSH-Px和SOD活性测定试剂盒规定步骤反应,用751分光光度计测量光密度, 分别计算细胞内GSH-Px活性和SOD活性。

1.4Catalase活性测定同上法制备BECs匀浆, 取匀浆50 μl,加入到2?950 μl过氧化氢反应液(PBS 50 ml加30% H2O2 57 μl)中, 用紫外分光光度计在230 nm处测定0 s和60 s光密度值, 计算上清液对H2O2的降解速率, 反映catalase活性单位。

cAT活性(mU)=5.5387×Log (OD0/OD60).

1.5细胞内GSH含量测定制备BECs匀浆, 在pH 8.0测定样品中的GSH, 用荧光分光光度计在激发光波长338 nm、 发射光波长422 nm处测荧光值,由标准曲线计算样品的GSH含量。

1.6实验分组及统计学处理设置: (1) 对照组; (2) Fn (10 μg/ml)处理组; (3) Fn (10 μg/ml)加W7 (10－5 mol/L)处理组; 另观察Fn (5~20 μg/ml)量-效关系及RGD肽(15~60 μg/ml)的量-效关系。

数据以均数±标准差表示, 统计学处理用相关分析、 t检验。 2结果

2.1整合素-配体反应对GSH-Px活性的促进作用

fn (10 μg/ml)处理可提高BECs的GSH-Px活性(P＜0.05), Fn的该效应可被Ｗ7阻断(P＜0.05)。浓度在5~20 μg／ml范围的Fn及浓度为15~60μg/ml的RGD肽均呈剂量依赖性地促进GSH-Px活性。

2.2整合素-配体反应对SOD活性的影响

对照组BECs的SOD活性为1.56±0.45亚硝盐单位(NU/106 cell), Fn (10 μg/ml)提高SOD活性(P＜0.01), fn的效应可被W7阻断(P＜0.01) 。

2.3整合素-配体反应对BECs过氧化氢酶活性的影响

fn (10 μg/ml)明显增加BECs的过氧化氢酶活性(P＜0.05), 且Fn的效应被W7逆转(P＜0.01)。

2.4BECs内GSH含量的变化

实验观察到, Fn (5~20 μg/ml) 呈剂量依赖性地提高细胞内GSH含量 (r=0.82); RGD肽(15~60 μg/ml) 的量-效关系也十分明显(r=0.84)。

3讨论

整合素是细胞膜上的异源二聚体蛋白, 由α和β两个亚单位组成。 α亚单位识别胞外基质分子(如Fn)中的RGD结构域片段, 跨膜的β亚单位将信号转导至胞内,激活多种蛋白激酶, 调控细胞功能。 因此, 整合素是细胞“感知”自身形态并对环境发生适应反应的信号传递分子。 气道上皮细胞在损伤修复过程或培养状态下,整合素α5β1或αVβ1表达增多, 调节细胞的增殖、 迁移和粘附[3]。 这两种整合素分子的主要配体是纤维连接蛋白,后者可上调细胞的成活力和粘附亲和力[4]。当培养细胞没有与基质结合粘附时, 细胞不能贴壁生长而易发生凋亡。 已知凋亡的机制与细胞内氧化性损伤有关[5],提示整合素与其配体结合可能改善细胞的抗氧化能力, 具有细胞保护作用。 本研究观察到, 用纤维连接蛋白处理培养的兔支气管上皮细胞, 细胞内的抗氧化酶GSH-Px、 sOD、 catalase活性整体提高, 且抗氧化物质GSH的量增加。本文用合成的RGD肽处理细胞也观察到相似的结果。 sOD的作用是将超氧阴离子歧化为过氧化氢, GSH-Px利用GSH还原过氧化氢成水, 而catalase则直接降解过氧化氢,三者在细胞内构成协调的抗氧自由基防线。 细胞外基质成分与整合素的结合上调抗氧化酶的活性, 具有保护意义。 如气道上皮细胞表达整合素分子的种类、数量或分布发生异常缺陷, 或气道上皮下基膜的基质蛋白成分发生改变, 则将影响上皮的抗损伤能力, 成为气道高反应疾病(如哮喘)的发病基础。

在气道上皮细胞的抗氧化系统中, GSH的作用及其代谢酶引人注意。 细胞内GSH的水平决定于GSH的上游合成速率及GSH与GSSG的相互转化。 本组曾报道EGF可增加BECs细胞内GSH水平及过氧化氢酶活性[6]。 bECs细胞膜上r-谷氨酰转肽酶丰富, 该酶催化细胞外GSH降解并被转入细胞内的反应, 为细胞内合成GSH提供关键性底物, 而EGF可上调该酶表达[7]。 fn与整合素的结合反应是否特异性地作用于细胞的抗氧化系统, 拟在今后的研究中进一步阐明。

整合素信号转导过程与EGF等生长因子受体相似, 都有酪氨酸蛋白激酶(TPK)参与。 有文献报道[8], 整合素信号转导与Ras蛋白-MAPK等级联反应有关,但也存在IP3、 Ca2+-钙调素或PKC途径。 本实验观察到Fn的效应可被钙调素抑制剂W7所阻断, 提示钙调素为整合素-配体反应的胞内信号传递环节。近年来认为, 氧化应激产生的活性氧如H2O2在亚毒剂量时可充当信号分子, 增加IP3敏感性胞内Ca2+浓度、 激活酪氨酸蛋白激酶或丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,因而参与调节细胞的多种功能。整合素-胞外基质蛋白结合反应通过TPK、 IP3-Ca2+-钙调素或PKC信号级联反应传递, 调节细胞内抗氧化系统活性水平,可能是一种细胞内负反馈信息控制机制。详细证据, 有待于进一步研究。

参考文献

[1]Herard AL, Pierrot D, Hinnrasky J et al. Fibronectin and its α5β1-integrin receptor are involved in the wound-repair process of airway epithelium. Am J physiol, 1996, 271: L726~L733.

[２]Qin XQ (秦晓群), Sun XH (孙秀泓), Zhang CQ (张长青). Technique of enzyme digestion adding brushing for isolating bronchial epithelial cells. Bull Hunan Med Univ(湖南医科大学学报), 1999, 24: 74~76 (Chinese, English abstract).

[３]White SR, Dorscheid DR, Rabe KF et al. Role of very late adhesion integrins in mediating repair of human airway epithelial cell monolayers after mechanical injury. Am J Respir Cell Mol Biol, 1999, 20: 781~796.

[４]Aoshiba K, Rennard SI, Spurzem JR. Fibronectin supports bronchial epithelial cell adhesion and survival in the absence of growth factors. Am J Physiol, 1997,273: l684~L693.

[５]Read JC. Bcl-2 and the regulation of programmed cell death. J Cell Biology,1994, 124: 1~5．

[６]Qin XQ (秦晓群), Sun XH (孙秀泓), Luo ZQ (罗自强) et al. Cytoprotective effect of epidermal growth factor on cultured rabbit air