摘要：本文观察了运动性低铁状态大鼠骨髓细胞转铁蛋白(Tf)结合铁和非Tf结合铁摄入的变化。大鼠随机分为6个月的运动组(EG)和对照组(SG)。SG平均每个幼红细胞Tf受体数为890150±164 849个, 而在EG为2 175 360±462 737个(P＜0.05), 但受体的解离常数不受运动影响。 EG中Tf的内吞平台和胞内铁聚积速度显著高于SG, 胞浆和胞内膜性成分中Tf结合铁和Fe(Ⅱ)摄入增加。EG的胞浆内Fe(Ⅱ)摄入的米氏常数值降低;细胞膜性成分中Fe(Ⅱ)摄入的最大速度增加。上述结果表明, 运动不仅通过增加Tf受体的表达促进Tf结合铁的内吞, 而且增强非Tf结合铁的内吞途径。尽管这些变化的机制尚不清楚,但它们有利于运动时血红素的合成。剧烈的运动可以诱导机体的低铁状态, 这种低铁状态表现为血清铁和铁蛋白浓度降低而血液血红蛋白(Hb)浓度不变或降低［1］。运动诱导低铁状态机制的研究主要是基于对铁的吸收和丢失之间的失衡、体内铁动力学的变化以及铁的利用与毒性等方面的观察,但这种低铁状态的本质, 尤其是否为铁缺乏, 迄今尚不清楚。

近年来, 有关细胞铁代谢的研究已取得了较大的进展［2］。骨髓红细胞可通过转铁蛋白(Tf)结合铁和非Tf结合铁摄入途径获得铁［3,4］ 。前者是由Tf与其受体结合,经过细胞内吞、 囊泡内酸化、 铁由囊泡向胞浆跨膜释放、 携带有Tf-受体复合物的囊泡与胞膜融合和 Tf释放与再循环的过程。而非Tf结合铁具有不经细胞内吞、没有钙的依赖性和其它金属元素竞争等特性, 涉及到载体转运、 单纯扩散等机制。在机体或细胞铁缺乏时, Tf结合铁和/或非Tf结合铁摄入的过程表现异常［5,6］。我们基于过去对铁代谢研究的基础,在运动诱导的低铁状态模型大鼠观察骨髓细胞的这两个摄铁过程, 探讨运动对铁代谢影响的细胞机制。

1材料和方法

1.1试剂59FeCl3(18.5×104 Bq/μg)和Na125I 为Amersham公司产品(英国)。Pronase为Calbiochem公司产品(美国)。其它试剂及试剂盒均为Sigma公司产品(美国)。有关铁的分析试剂为最低铁含量的分析纯级试剂。

1.2动物和运动模型雌性Sprague-Dawley 大鼠, 体重190～250 g, 饲养于不锈钢底的标准笼内, 自由饮食, 饲料为PMI nutrition公司成品(No 5001, 美国)。动物分为运动组(n=11) 和对照组 (n=8), 运动组大鼠在水深50 cm和水温35±1℃的有机玻璃游泳池内游泳, 每天1次, 每周游5 d (周六、 日休息)。每次游泳持续时间为: 第1周30 min, 第2周1 h,第3周后固定为1.5 h。运动期长达6个月。对照组除运动外, 其余处理与运动组相同。 运动期满后, 两组均禁食24 h, 动物断头取血。

1.3骨髓单个核细胞的分离胫骨和腓骨折断后, 在断端用0～4℃的生理盐水洗出骨髓细胞, 通过两层尼龙网［7］的细胞悬液被置于单核细胞分离液(histopaque)的上端,密度梯度离心获得骨髓单个核细胞［5］。用Hank平衡液(HBSS, pH 7.4, 4℃)稀释单个核细胞悬液至1×108 细胞/ml, 4℃保存, 3 h内使用。细胞涂片, May-Grünwald-Giemsa染色, 作幼红细胞计数, 总计数为500个单个核细胞。

1.4铁饱和Tf大鼠去铁Tf溶于0.1 mol/L NaHCO3的溶液, 在4℃下用铁溶液饱和Tf［8］。HBSS透析。根据280 nm时溶液的光密度决定Tf的浓度, tf铁饱和时A465 nm/A280 nm 比值在0.045～0.048。-20℃储存备用。

1.5Tf同位素标记 125I和59Fe标记Tf［3］。即大鼠去铁Tf与59Fe饱和后通过层析柱分离得到Tf-59Fe, 再通过氯胺T法与125I反应,在4℃下再通过层析柱分离、 HBSS透析, 得到双标记的Tf。 -20℃储存备用。

1.6Tf结合试验参照Muta等方法［5］, 2×105个单个核细胞与不同浓度的标记Tf (0.12～70 nmol/L)在4℃下孵育60 min。为了测定Tf的非特异性结合, 在与上述平行的管中预先加入100倍于标记Tf的非标记Tf。孵育结束后, 细胞悬液置于120 μl二丁基邻苯二甲酸的顶部(400μl Eppendorf离心管), 5000 g 离心1 min (4℃)。切下管尖作放射性计数。

1.7细胞Tf和铁摄入骨髓单个核细胞悬液在37℃下预孵育10 min, 然后加入59Fe-Tf-125I, Tf终浓度为0.5 μmol/L,以不同的时间间隔, 分别吸出100 μl (2×106细胞)的细胞悬液, 用40倍容积的冰冷磷酸盐缓冲液(PBS)以稀释终止铁摄入［4］。2 ml冰冷PBS洗细胞3次后, 加入200 μl Pronase (0.1%), 孵育30 min (4℃), 再洗细胞3次以去除细胞膜表面结合的Tf和铁［3］。为了测定细胞Tf的内吞,细胞悬液置于二丁基邻苯二甲酸的顶部, 离心, 并作管尖125I放射性计数。为了测定细胞内铁的分布, 另一份细胞悬液被转移到一套试管中,低渗透压和洗涤剂［3］同时作用于细胞, 通过离心将细胞浆和膜性成分分开［3］, 分别作59Fe放射性计数。

1.8非Tf介导的铁摄入用Fe(Ⅱ)摄入代表非Tf铁摄入［3，4］。59Fe与56Fe以1∶10的摩尔浓度比混合, 再加50倍二巯基乙醇, 用0.27 mol/L的蔗糖溶液稀释到终铁浓度62.5 μmol/L。通过将不同体积的该溶液加入含有5×105 个骨髓单个核细胞的悬液中, 得到不同浓度铁的细胞悬液0.50 ml。 在37℃下孵育30 min后, 用冰冷生理盐水洗细胞3次, 溶解细胞、 离心分开胞浆和膜性成分, 分别作59Fe放射性计数。

1.9其它用氰化钾法测定血液Hb浓度。 用毛细管离心法测量血液红细胞压积(Hct)。使用试剂盒测定血浆铁(PI)浓度和Tf的铁饱和度(TS)。三通道γ计数器(Packard 5003, Packard Instrument Co. 美国)测量放射活性。 Scatchard作图决定Tf特异结合的最大结合位点数和Tf与受体的解离常数。分维分析用于计算细胞内Tf的摄入速度［9］。Fe(Ⅱ)摄入的米氏常数和最大摄入速度由Eadie-Hofstee法决定。数据用均数±标准误表示(x±s),统计学处理采用组间比较的t检验。

2结果

2.1运动对铁状态血液学指标的影响

在运动组Hb浓度和Hct分别为141±7 g/L和(39.7±0.9)%, 而在对照组的相应值是152±8 g/L和(40.4±0.9)%, 两组间Hb浓度和Hct没有显著性差异(P＞0.05)。血涂片中两组的红细胞形态大小正常。然而,运动组PI浓度和TS与对照组相比显著降低, 对照组PI和TS分别是32.8±0.48 μmol/L和(43.8±4.9)%,而运动组的相应值分别是19.9±0.19 μmol/L (P＜0.001)和(26.3±1.9)% (P＜0.01)。尽管Hb和Hct没有发生显著变化,但降低了的PI和TS表明运动诱导了低铁状态。

2.2125I-Tf与受体的结合分析

运动组的骨髓单个核细胞悬液中幼红细胞数为(20.82±2.5)%, 对照组为（14.92±1.6）%。

在对照组, 每个幼红细胞Tf受体平均为890150±164849个, 而运动组的Tf受体数显著增加, 为2175360±462737 (P＜0.01)。运动组的Tf与其受体间的解离常数为9.3±1.9 nmol/L, 而对照值为12.7±2.2 nmol/L, 两组间没有显著差别(P＞0.05)。这些结果表明, 运动可导致骨髓幼红细胞表面Tf受体表达增加, 但不影响受体与Tf的亲和力。

2.3Tf的内吞和Tf介导的铁摄入

Tf受体介导的Tf内吞在孵育开始时几乎以线性上升, 然后进入内吞平台。在30 min的时间点, 运动组幼红细胞Tf内吞为9.93±2.08 pmol/106细胞,显著高于对照值4.06±0.99 pmol/106细胞(P＜0.05)。运动组和对照组大鼠的细胞内同位素铁摄入以线性方式随时间增加, 在5～30 min内的各时间点, 运动组大鼠摄入的铁显著多于对照组。上述结果表明 , 运动引起了幼红细胞Tf的内吞活性和细胞铁摄入增加, 这与2.2中Tf受体表达增加的观察一致。

两组大鼠骨髓幼红细胞摄入铁在不同部分的聚积。运动组大鼠在2, 10, 20 min三个时间点幼红细胞膜性成分中铁的聚积高于相应的对照值,在20和30min两个时间点胞浆铁的聚积高于相应对照值。对铁聚积速度的分析显示, 对照组铁在膜性成分中的聚积速度为3.21±0.59 pmol/(min.106细胞),胞浆中的聚积速度为1.35±0.38 pmol/ (min.106细胞); 而运动组相应值为6.17±1.26 pmol/(min.106细胞)和2.91±0.47 pmol/(min.106细胞), 显著高于对照组(均P＜0.05)。

2.4骨髓单个核细胞Fe(Ⅱ)摄入

在运动组, 单位时间内细胞膜性成分和胞浆铁摄入量显著大于对照组

运动组细胞膜性成分的非特异性铁摄入为0.12±0.02 pmol/(min.106细胞), 显著高于对照组0.04±0.01 pmol/(min.106细胞)(P＜0.01)。但两组间胞浆的非特异性铁摄入没有显著性差异, 运动组为0.05±0.01 pmol/(min.106细胞), 对照组为0.04±0.01 pmol/(min.106 细胞) (P＞0.05)。 在特异性铁摄入过程中, 运动组骨髓单个核细胞的胞浆米氏常数为0.08±0.01 μmol/L,显著低于对照组(0.21±0.03 μmol/L, P＜0.01)。 运动组和对照组的细胞膜性成分的米氏常数分别为0.12±0.03 μmol/L和0.15±0.02μmol/L, 没有显著性差别。运动组细胞膜性成分的最大摄入速度为0.33±0.02 pmol/(min.106细胞), 显著高于对照组相应值0.24±0.04 pmol/(min.106 细胞) (P＜0.05)。在胞浆部分, 两组的铁摄入最大速度相似, 分别为0.30±0.02 pmol/(min.106细胞)和0.29±0.02 pmol/(min.106细胞) (P＞0.05)。上述结果显示, 运动可以引起细胞Fe(Ⅱ)摄入的增加, 铁在向胞浆和膜性结构转运过程中机制不同。

3讨论

有研究表明, 细胞Tf受体介导的Tf结合铁摄入的活动主要由细胞内铁的水平决定。细胞铁缺乏时, 通过Tf受体的转录后调节引起Tf受体表达增加,铁摄入增强。反过来, 细胞Tf受体表达增加,