摘要：利用表达性差异显示分析 (RDA)技术, 研究大鼠2/3肝部分切除后1 h肝组织中基因的选择性表达, 建立了大鼠2/3肝部分切除术后1 h再生肝组织选择性表达基因EST库。该库约含3×104个独立克隆, 其中95%以上的克隆含有插入片段, 长度约200~700 bp不等,对随机挑出的52个克隆的序列分析表明其中大多数基因与肝再生调控相关(38/52)。10株未报道序列经RNA杂交证实, 其中6株与肝再生相关。成年哺乳动物肝脏99%以上细胞均处于静止状态, 但受到损伤时, 几乎所有残存的正常肝细胞会迅速进入细胞增殖,因此肝再生模型是研究体内细胞增殖较理想的模型[1]。肝再生可分为启动、 进行和终止三个过程, 各个阶段受到不同基因的调控,其中如何形成肝生长前的“感受态”是至关重要的, 一般认为早期反应基因可能在此过程中起重要作用[2]。尽管目前已知多种早期反应基因与肝再生相关,但公认的看法是还有大量未知基因与此过程相关。本研究利用表达性差异显示分析(representational difference analysis, rDA)技术[3]建立了肝部分切除后1 h差异表达基因(expressed sequence tags, EST)库,对其中52株克隆序列分析表明该库大部分基因与肝再生调控相关,其中金属硫蛋白及胰岛素样生长因子结合蛋白-I等与肝再生密切相关基因得到高度富集。10株未知基因经RNA杂交证实, 其中6株确与肝再生相关。

１材料和方法

1.1 动物模型 Wistar雄性大鼠,体重180±10 g, 购自军事医学科学院动物中心。按Higgins[4]的方法行2/3肝部分切除术(partial hepatectomy,PH), 并于术后不同时间取再生肝组织。对照组动物行剖腹术并牵引肝脏, 但不行肝部分切除。每组3只动物。

1.2 mRNA提取 新鲜肝组织以Total RNA Isolation System (Promega公司) 分离总RNA, 并纯化mRNA。

1.3 RDA 以PH后1 h再生肝mRNA (1.0 μg)为实验(tester) mRNA, 对照组mRNA为“驱使”(driver)RNA, 按clontech公司试剂盒操作手册进行RDA。主要过程为: 将两种mRNA分别进行反转录, 实验组cDNA以过量的“驱使”cDNA于68℃杂交过夜, PCR扩增差减产物,并以G3PDH为标志基因评价差减效果。取1/50差减扩增产物连接入T载体, 转染大肠杆菌, 并鉴定阳性重组子。

1.4 差减效果评价 以管家基因G3PDH为内标准基因, 利用PCR检测该基因差减前后的表达水平, 依此评价差减效果。PCR引物为:正链5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′, 反义链5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。条件为94℃ 30 s, 60℃ 30 s, 72℃ 30 s, 分别于PCR第18、 23、 28和33循环取样, 进行2.0%琼脂糖凝胶电泳。

1.5 序列分析及同源性检测 以PE公司377型自动测序仪测定阳性重组子序列, 并以BLAST与GeneBank序列(包括EST序列库)进行同源性比较。

1.6 RNA狭缝杂交 取PH后不同时间总RNA各10.0 μg, 以负压吸附法将其印迹在狭缝点样器夹层中的NC膜上。G3PDH (400 bp)、胰岛素样生长因子结合蛋白-1 (500 bp)及序列分析所获10株克隆DNA片段(300~600 bp)分别用Promega公司随机引物标记试剂盒标记, nC膜于56℃杂交过夜后, 以2×SSC,0.1% SDS液室温洗2次; 0.1×SSC, 0.1% SDS, 50℃洗2次, -70℃曝光过夜。

1.7 Northern杂交 取总RNA20 μg 进行1% 甲醛变性凝胶电泳, 转印硝酸纤维素膜, 膜在80℃烘干2 h, 加入6×SSC、5×Denhandt′s、 0.5% SDS和100 μg/ml鲑精DNA, 在68℃预杂交1 h, PC3基因及胰岛素样生长因子结合蛋白-1 DNA片段以32P-dCTP标记, 变性后加入预杂交液, 68℃杂交过夜。用含0.5% SDS的2×SSC室温下洗膜2次, 再用含0.5% SDS的0.5×SSC50℃洗膜2次,室温干燥后－70℃下放射自显影。

2结果

２.１ 差减效果评价

2.2 序列结果分析

取1/50 PCR扩增差减产物(约50 ng)连接入PGEM-T载体, 转化大肠杆菌JM109, 共获约600个转化子,白色菌落占96%。随机挑出11个白色菌落, 经PCR鉴定均含有插入片段, 长度约200~700 bp不等。因此, 所有PCR扩增差减产物经连接、转化约可获得600×50(3×104)个独立克隆, 其中95%以上的克隆含有插入片段。随机挑出52个阳性重组子进行序列分析, 正、反引物测序结果及其相对应的序列分析。其中42株为已报道序列, 经检索,其中30株已有报道与肝再生调控相关。Metallothionein家族蛋白[5]出现的频率达11/42; 胰岛素样生长因子结合蛋白-1(IGFBP-1)[6]出现的频率为2/42, 这两种基因均与肝再生密切相关。此外, 还获得10株未注册的新序列。

2.3 RNA狭缝杂交

为确证未报道基因与肝再生的关系, 我们从2/3肝部分切除术后不同时间大鼠提取再生肝RNA, 以10株未报道EST序列DNA片段为探针,进行了RNA狭缝杂交。结果表明其中6株克隆基因(C~H)在PH后表达增加, 半定量分析表明分别增加3~8倍。其中A为G3PDH探针(阴性对照), b为IGFBP-1探针(阳性对照)。

2.4 Northern 杂交结果

在42株已报道序列中含有2株PC3基因克隆, 与胰岛素样生长因子结合蛋白-1 (IGFBP-1)基因出现频率相同, iGFBP-1是一种与肝再生密切相关的早期反应基因, 因此提示PC3基因可能与肝再生密切相关。PC3基因是神经生长因子(NGF)诱导产生的一种分泌蛋白,属瞬时早期反应基因[7], 国内外尚未见PC3基因与肝再生相关的报道。为验证PC3基因的表达是否与肝再生相关,我们采用Northern杂交证实PC3基因的表达确与肝再生调控相关。如图4所示, 正常肝组织中PC3基因mRNA有低丰度表达, 2/3 PH后1~2 h表达迅速增加7~10倍, 以后mRNA水平恢复到正常肝组织水平。IGFBP-1在2/3肝部分切除后的表达也迅速增加, 其表达时相与文献报道一致[6]。

3讨论

基因选择性表达是许多生理和病理现象的基本调控方式。大鼠2/3肝部分切除后, 首先表达的是一组早期反应基因, 这组基因目前已发现数十种, 其中包括c-fos、 c-jun、 LRF、 PNF/NF-KB等[6]。现今认为此类基因在肝再生调控中起着关键作用, 它们的表达可导致肝细胞进入“感受态”,在此基础上生长刺激因素才可调控肝细胞的增殖。由于肝再生具有明显的器官特异性, 因此必定有肝器官特异性的某些调控基因存在。近年来,肝器官特异性早期反应基因时有发现, 它们对解释肝再生的器官特异性具有重要意义。本研究利用RDA技术构建了2/3肝部切除后1 h再生肝选择性表达基因EST库,该库约含600×50 (3×104)个独立克隆, 其中95%以上的克隆含有插入片段, 长度约200~700 bp不等。选择术后1 h是依据大多数早期反应基因的表达高峰均在术后1 h而确定的。对该EST库部分序列测定的结果表明, 该库富集了肝再生调控相关基因,相关基因频率高达73%(38/52)。这为全面研究PH后早期基因变化提供了有力的保障。目前, 我们正利用基因芯片技术, 对该文库进行更深入全面的分析。

序列测定结果表明, 该库19%(10/52)的基因为新序列, 其中大部分均可被肝部分切除诱导表达, 增加倍数达3~8倍,表明这些序列可能与肝再生调控有关。其中一株具有酪氨酸激酶结构域, 并在多种肿瘤细胞中表达。目前, 我们正在对这些EST序列进行全长cDNA的克隆,并将深入研究它们的生物学功能。

参考文献

[1]Michalopoulos GK. Liver regeneration: molecular mechanisms of growth control. fASEB J， 1990, 4: 176~187．

[２]Taub R. Transcriptional control of liver regeneration. FASEB J，1996, 10:413~427．

[３]Hubank M, Schatz DG. cDNA representational difference analysis: a sensitive and flexible method for identification of differentially expressed genes. methods Enzymol,1999, 303: 325~３49．

[４]Higgins GM, Anderson RM. Experimental pathology of the liver. I. Restoration of liver of the white rat following partial surgical removal. Arch Pathol, 1931,12: 186~202．

[５]Webb. Metallothionein in regeneration, reproduction and development. EXS,1987, 52: 483~４98．

[６]Weir E, CHEN Q, Defrances MC et al. Rapid induction of mRNA for liver regeneration factor and insulin-like growth factor binding protein-1 in primary culture of rat hepatocytes by hepatocyte growth factor and epidermal growth factor. Hepatology， 1994, 20 (4): 955~960.

[７]Bradury A, Possenti R, Shooter EM et al. Molecular cloning of PC3, a putatively secreted protein whose mRNA is induced by nerve growth factor and depolarization. Proc Natl Acad Sci USA, 1991, 88: 3353~3357.