摘要：通过胆碱能激动剂乙酰胆碱及离子诱导剂A23187(以下简称激动剂)作用于分离的肾上腺髓质细胞,以引起离体细胞的刺激-分泌耦联过程。运用细胞立体形态计量法计算分泌过程中的嗜铬颗粒数目的变化, 运用电镜X射线显微分析法测量分泌过程中嗜铬颗粒内钙含量的变化,并运用高压液相色谱分析法测定离体细胞在激动剂作用后的肾上腺素分泌情况。结果发现, 分离的肾上腺髓质细胞嗜铬颗粒内钙含量在激动剂作用10 min时有明显下降,颗粒数目在激动剂作用过程中呈缓慢下降趋势, 而细胞悬液中的肾上腺素含量在激动剂作用20 min以后有明显的升高。激动剂作用引起的离体肾上腺髓质细胞分泌时颗粒内钙含量的下降早于颗粒数目减少或肾上腺素升高,提示颗粒释放的Ca2+可能是引起细胞分泌的原因之一。肾上腺髓质细胞是一种内分泌细胞, 其胞质内的嗜铬颗粒含有大量儿茶酚胺类激素, 当发生刺激-分泌耦联时,这些颗粒主要以胞吐的形式向细胞外分泌肾上腺素和去甲肾上腺素, 以引起相应的机体反应。在刺激-分泌耦联过程中,受激素等物质的刺激或膜内外电压的改变使膜上钙离子通道开放, 导致细胞外Ca2+内流, 或细胞内含有高钙的细胞器释放Ca2+ 到胞质中,从而引起细胞的分泌[1]。

细胞内的某些细胞器能够逆浓度梯度地从胞质中摄取钙(通过钙泵或其它方式), 以较高的浓度贮存钙(具有高结合量、低亲合力特性的钙结合蛋白), 并能在需要的时候释放 ca2+ (通过激活单位膜上相2期 刘懿等: 乙酰胆碱和A23187对离体大鼠肾上腺髓质细胞肾上腺素分泌的作用生理学报 Acta Physiol. Sin.53卷关受体或其它途径)。这类细胞器被称为细胞内钙库。钙库广泛存在于真核类细胞中, 随着人们对其研究的深入,发现细胞内的许多细胞器如线粒体、内质网等都具有钙库特性[2]。

ornberg等[3]曾测得嗜铬颗粒内含有较高浓度的钙, 而嗜铬颗粒的内容物是由儿茶酚胺、ATP、蛋白质及钙组成的复杂的混合体[4], 在钙库学说提出后,嗜铬颗粒内的钙是否参与自身颗粒内儿茶酚胺的释放成为一个有趣的课题。另外, 已经确认肾上腺髓质细胞内含有钙库[5], 但将它们联系到嗜铬颗粒的证据尚不足,因此有必要从更多的途径阐明肾上腺髓质嗜铬颗粒的钙库机能。本文拟用胆碱能激动剂乙酰胆碱及离子诱导剂A23187(以下简称激动剂)作用于分离的肾上腺髓质细胞,用电镜X射线显微分析技术测量用药过程中颗粒内钙含量的变化, 对嗜铬颗粒进行形态计量并测量细胞悬液中的肾上腺素含量以反映用药时细胞的分泌水平,进而从肾上腺素分泌和颗粒钙含量两者变化关系来探讨激动剂作用时颗粒钙的释放在刺激-分泌耦联中的可能作用。

１材料和方法

1.1 大鼠肾上腺髓质细胞的分离每次取5只大鼠的肾上腺, 去除皮质后, 将肾上腺髓质切成1mm3小块后, 用HEPES缓冲液(mmol/L: NaCl137, KCl 3, Na2HPO4 0.7, HEPES 25, 葡萄糖 10, pH7.2, 4℃)清洗组织块后, 加入5 ml0.1%胶原酶(type IA, 用HEPES缓冲液配制), 37℃恒温水浴振荡消化2 h后将细胞悬液在80-1型离心机上2?000r/min离心5 min,所得细胞团用1% BSA溶液(HEPES缓冲液配制)清洗两次, 细胞悬液中细胞个数约为2×105_?ml,用台盼蓝染色计算细胞活率平均为92%。最后将离心所得细胞团置于冰上待用。

1.2 激动剂对分离细胞作用的检测

1.2.1 ACh激动剂作用的检测向上述分离的细胞团中加入5 ml ACh孵育液(氯化乙酰胆碱0.5 mmol/L, CaCl2 2.2 mmol/L, BSA1%, 用HEPES 缓冲液配制, pH 7.2), 置于37℃恒温水浴振荡孵育, 根据孵育时间的不同分成10、20、30、40和50 min组,空白对照组用1% BSA孵育50 min, 在各组结束孵育之后, 孵育液2?000r/min离心5 min, 把所得细胞团和上清液分别置于冰上待用。

1.2.2 A23187激动剂作用的检测作用方式与ACh相同, A23187孵育液含A23187 2 μmol/L, BSA 1%, (用HEPES缓冲液配制, pH 7.2), 将所得细胞团和上清液分别置于冰上待用。

1.3 分离细胞的常规电镜制样及其立体形态计量法将上述所得的细胞团切成小于1 mm3的小块, 置于2.5%戊二醛(0.1 mol/L磷酸缓冲液配制, pH7.4)4℃固定2 h, 经0.1 mol/L磷酸缓冲液漂洗后, 用1% OsO4 (0.1 mol/L磷酸缓冲液配制)4℃后再固定2 h。用梯度酒精脱水, spurr树脂包埋, 于70℃烤箱聚合8 h。LKB Ⅰ型超薄切片机切片, 切片经枸橼酸铅和醋酸铀双重染色后在JEM-1200EX透射电镜下观察拍片。

根据刘懿等[6]的细胞立体形态计量方法, 测定嗜铬颗粒数密度(Nv)。激动剂孵育10、20、30、40、50 min和对照组每组5只动物,每只动物拍摄30张电镜照片。计算每张照片所得的Nv值, 各制动组的Nv均数与对照组Nv均数作t检验分析。

1.4 肾上腺素高效液相色谱(HPLC)测定法经激动剂作用后的细胞悬液离心所得的上清液5 ml加入高氯酸0.3 ml,均匀混合后, 30?000 g离心10 min, 对上清液作肾上腺素的HPLC测量。使用Waters 高效液相色谱仪, 分离柱Nova-Pak C18, 150×3.9 mm. id,粒径5μm,柱温23℃。流动相0.68% NaAc, 0.01% EDTA-2Na, 1%离子对色谱试剂(IPR-B7),用HAc调pH至4.0, 含8%甲醇, 流速1 ml/min。检测器电压0.65 V。测量样品中的肾上腺素峰高, 与肾上腺素标样比较, 推算出样品肾上腺素含量(ng/ml)。

1.5 磷钨酸乙醇(EPTA)染色法取材所得的肾上腺髓质组织块或细胞团分别于2.5%戊二醛4℃固定2h[7], 然后递增浓度乙醇脱水至纯酒精后,在100%纯酒精中加入2%磷钨酸, 室温染色5 h, 再用纯酒精漂洗, 经环氧丙烷置换后用Spurr包埋剂包埋, 70℃聚合8 h, 用LKBⅠ型超薄切片机切片, 超薄切片直接在带有能谱的电镜下观察分析。

1.6 新鲜组织冷冻样品制备分离肾上腺髓质获得肾上腺髓质细胞团, 立即在Reichert KF-80型快速冷冻仪－158℃下作快速冷冻固定,然后用Reichert-Ultracut E FC4D型冷冻超薄切片机切片。 切片时样品室内温度为－130 ℃, 刀台温度为－100℃,样品台温度为－110℃。 所得切片用竹丝捞至载网, 带有切片的载网于低温下转移至5×10－6 Torr真空下冷冻干燥8 h, 再于切片表面喷镀薄层碳膜,即可在带有能谱附件的透射电镜下观察分析。

1.7 电镜X射线显微定量分析法测定嗜铬颗粒内钙含量将EPTA染色的切片和新鲜组织冷冻超薄切片在JEM-1200EX透射电镜下观察, 并用Link aN-10000能谱仪进行元素分析。分析时采用透射模式, 电镜用六硼化镧灯丝, 加速电压80 kV; 将电子束聚焦于嗜铬颗粒, 电子束直径小于0.2 μm;调节X射线计数率为1200 cps左右, 收谱时间200 s, 记录X射线能谱图。谱线用Link公司提供的Quantem/FLS生物薄试样定量分析软件处理,对谱线中钙元素进行定量计算, 给出mmol/kg(干重)为元素浓度单位。

2结果

2.1 激动剂作用时离体大鼠肾上腺髓质细胞嗜铬颗粒数目的变化

正常大鼠分离细胞(图1A)在电镜下细胞膜完整, 核规则, 胞质内见大量单位膜包绕的嗜铬颗粒, 其内容物呈中等电子密度,可见分离细胞的细胞形态及颗粒形态与组织细胞无明显差异。ACh及A23187分别作用后的细胞形态见图1B、C。激动剂作用后, 细胞内嗜铬颗粒数目略有减少,颗粒形态有明显变化, 有的颗粒直径较大, 有的内容物电子密度浅淡或内容物缺失呈空泡状。

在ACh以及A23187激动剂作用10、20、30、40、50 min后, 计量分离细胞内的嗜铬颗粒Nv值。

分离的肾上腺髓质细胞在Ach及A23187作用过程中,颗粒数密度随作用时间的增加而下降,其中A23187从30 min开始与对照组有显著差异(P＜0.01),ACh作用40及50 min时与对照组有显著差异(P＜0.01)。

2.2 激动剂作用时离体大鼠肾上腺髓质细胞嗜铬颗粒内钙含量变化

使用EPTA染色法获得的大鼠肾上腺髓质细胞形态如图1D, 除了细胞核及颗粒电子密度深染外,其它细胞器均未着色。对EPTA染色切片用电镜X射线显微定量分析法测定嗜铬颗粒内的钙含量, 并与快速冷冻-冷冻超薄切片的测量结果比较,发现两种切片细胞颗粒内钙离子浓度分别为12.38±3.16(EPTA法)和33.74±4.52(快速冷冻-冷冻超薄切片法) mmol/kg(干重)。对于相同来源的细胞冷冻超薄切片法和EPTA染色法保存的Ca2+含量不同(P＜0.01)。EPTA法测得的Ca2+含量值约为冷冻超薄切片法的三分之一。

分离的大鼠肾上腺髓质细胞在激动剂作用不同时间后用EPTA法测量颗粒钙含量变化。

a23187、 ACh作用时可引起分离的肾上腺髓质细胞颗粒钙含量的下降(P＜0.01),各激动剂作用不同时程组与对照组比较都有显著差异(P＜0.01), 其中激动剂作用10 min时颗粒内钙含量有较大幅度下降, 分别从用药前12.38±3.16 mmol/kg (干重)降至5.47±2.68 (ACh) 及6.59±3.71 (A23187) mmol/kg (干重)。

2.3激动剂作用过程中肾上腺髓质细胞的肾上腺素的分泌

用HPLC法对ACh及A23187作用不同时间组的细胞上清液中的肾上腺素进行测定。

从以上结果可知, ACh及A23187作用于离体肾上腺髓质细胞时, 引起了细胞悬液中肾上腺素含量的增加, 并都从作用20 min开始与正常对照组比较有极显著性差异(P＜0.01)。

3讨论

分离的正常大鼠肾上腺髓质细胞的形态与正常大鼠肾上腺髓质组织细胞无明显差别,嗜铬颗粒数密度为44.29±5.38个/μm3，与正常组织细胞中的47.89±3.87个/μm3[6]无显著差别(P＞0.05),分离细胞的嗜铬颗粒内钙含量为33.74±4.52 mmol/kg (干重)