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蔡东；瞿安连；徐建华华中理工大学生物物理与生物化学研究所；武汉；430074)；王晓民；韩济生；北京医科大学神经科学研究所；周专；中国科技大学生命科学学院蔡东；瞿安连；王晓民；周专；徐建华；韩济生
关键词：碳纤电极；分泌；肾上腺嗜铬细胞；电化学测量；MPP+
摘要：碳纤电极记录可用于对单个神经及内分泌细胞分泌过程进行电化学检测, 其中技术关键之一是碳纤电极的制作。 本文所介绍的碳纤电极的制作方法,简化了以往的工艺过程, 使成功率与一致性得到了提高, 同时检测灵敏度与噪声等指标满足了实验要求。 用这样制作的碳纤电极在大鼠肾上腺嗜铬细胞上研究1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)对于单胺能神经细胞递质胞吐过程的影响,发现MPP+对于胞吐没有直接的影响并且不增加高K+刺激所诱发的胞吐量。 从而提示以往所报道的将MPP+通过灌流方法作用于多巴胺能神经核团,短时间内使组织液中多巴胺含量上升, 可能是由于MPP+阻滞了重摄取过程所致。神经递质的释放以量子化胞吐为主要形式。 以往人们是用记录突触后电位来对神经递质分泌的生理过程和调控进行间接研究［1］。 近年来,一种新的分泌检测技术――碳纤电极安培测量法开始用于细胞分泌的研究。 它可以直接对胞吐出来的神经递质进行实时检测, 其时间、 空间、 化学和电学分辨率足以保证对分泌囊泡数量、 单个囊泡的容量和兴奋-分泌耦联过程研究的需要。 这一方法利用的是电化学原理,其适宜的检测对象为肾上腺素(E)、 去甲肾上腺素(NE)、 多巴胺(DA)、 5-羟色胺(5-HT)和抗坏血酸(ascordic acid,AA)等易被氧化的神经递质［2］。 这一实验技术的基本装备包括碳纤电极、 高性能(增益带宽积和信噪比)的膜片箝放大器和有1 kHz记录带宽的记录仪。 其中碳纤电极的制作是其技术关键。 以往的制作方法较复杂且成功率与一致性不理想［2,3］。本文介绍一种实用的改进方法,并使用这种电极在大鼠肾上腺嗜铬细胞上研究1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)对于神经递质分泌的影响。MPP+是一种可以损伤单胺能神经元并引起帕金森氏病症状的神经毒性基团［4］。
试剂与溶液胶原酶I (Collagenase I)、 透明质酸酶、 DNA酶、 AA为Sigma产品, DMEM (Dulbecco′s Modified Eagle Medium)为Gibco产品,MPPI (MPP iodine) 由美国RBI公司生产。
细胞外生理盐溶液成分(mmol/L): NaCl 140; KCl 2.8; CaCl2 5; MgCl2 1; HEPES 25；NaOH校定pH为7.4；用glucose调节渗透压至314 mOsm/kg H2O。 Hank′s 液成分(g/L): NaCl 8; KCl 0.4; glucose 1; KH2PO4 0.06; NaH2PO4 0.0475; NaOH校定pH为7.4。
高钾刺激液中含70 mmol/L的KCl, 其他成分除NaCl需按等渗要求调整为80 mmol/L外均与细胞外生理盐溶液相同。
向细胞外生理盐溶液或高钾刺激液中添加一定的MPPI制成400 μmol/L的MPP+ 刺激液。 每次实验时新鲜配制, 冰浴操作。
大鼠肾上腺嗜铬细胞的分离培养将体重200～300 g的成年Wistar大鼠颈椎脱臼处死后, 剖腹取出肾上腺, 迅速放入Hank′s液中。 剪除被膜及皮质,取出中央的髓质, 然后将其剪成碎块, 转移至含有消化酶的三角瓶中。 维持37℃, 匀速振荡, 每隔15 min吹打一次。 1 h左右, 将细胞在1?500转/min下离心3 min。 去上清液后再加入Hank′s液, 将细胞吹散, 以600转/min速度离心10 min。 去上清液, 只保留0.2 ml 的Hank′s液,将细胞重新吹起, 然后转入1.5 ml 的DMEM培养液中。
以每培养皿800～1?000的密度将细胞植入直径35 mm 的培养皿中, 静置15 min后将各皿的DMEM培养液补加到2 ml, 37℃、 5% CO2培养箱中培养2～4 d, 24 h换液一次［5］。
仪器与材料B-80型国产电极拉制仪(中山大学教学仪器厂), 国产体视镜(重庆光学仪器厂)。 碳纤维(直径7 μm)为Courtald Ltd. (UK) 生产。 聚丙烯微量取液头采用Ulster Scientific Inc(USA)产品。 膜片箝系统由EPC-9放大器(HEKA, Germany),Macintosh Quadra 650 (Apple, USA)计算机, Pulse+Pulsefit 8.0 软件 (HEKA, Germany)组成。用精密的压电微操纵器(Burleigh, USA)和三维机械微操纵器(Narishige, Japan)来控制碳纤电极与加药器。
碳纤维微电极的制作碳纤电极材料组成包括微碳纤丝和绝缘包被支持物两部分。 结构上由尖端探测部、 颈部和支持部组成。 早先的碳纤电极用玻璃作绝缘材料,需要先将碳纤穿引到玻璃毛胚管中, 然后经过毛胚管拉制、 电击切割、 绝缘胶封合、 尖端磨平和热处理等复杂工序［3］。 后来Robert Chow 等用聚乙烯塑料管作为绝缘材料, 将制作简化为穿引、 拉制和切割三步, 而且电极经过再加热, 再切割后可以重复使用［2］。然而这样制作的碳纤电极外形差异较大, 质量不易控制, 成功率较低。 后来Zhuan Zhou 用聚丙烯微量取液头作为绝缘材料, 制作出了噪声更低, 灵敏度更高的聚丙烯碳纤电极(propylene carbon fiber electrode, ProCFE)［6］。 本文详细描述了一种简便高效地制作ProCFE的新方法。 实验表明,用这种方法制备的ProCFE成功率高, 噪声低。 制作方法的改进使电极尖端的绝缘包被层更加均一, 并清除了以前电极尖端绝缘层的膨大部分, 因而便于在细胞周围的有限空间中放置其他装置,如膜片箝电极、 加药管等。 另外, 由于电极特性的一致性得到提高, 从而提高了实验数据的整体质量。
电极的制作过程为: (1) 准备: 取10 μl的微量取液头, 向其中注入无水乙醇, 将碳纤插入。 用洁净的定性滤纸将乙醇吸干, 注意不能将碳纤丝带出。静置若干分钟待剩余乙醇挥发, 将取液头的尾部固定于拉制仪左侧的夹具上, 使取液头从加热丝中间穿过, 并用右侧夹具将尖端夹紧。 加热丝作3圈绕制, 每圈的内径为5 mm, 圈间距为1.5 mm。 （2）拉制: 打开拉制仪的加热开关将温控指示调至“4”处。 待取液头融化并形成两个液珠后停止加热。 加热丝的余热使融化继续并使两个液珠分离,中间部分会暴露出碳纤丝。 等待约10 s使温度稍降, 然后手持左端夹持器匀速向左拉动约8 mm, 则左侧液珠被拉成锥状包绕在碳纤周围。 完全冷却后将右侧部分剪掉便制成了碳纤电极毛胚(如图1A)。(3) 切割: 切割装置包括切割垫板、 电极架、 刀架、 微操纵器和解剖显微镜。 切割垫板采用硬度适中的有机玻璃板。 电极架和刀架都通过磁性基座固定在厚重的铁板上。将电极毛胚固定在切割装置的电极架上。 检查刀片在切割板上的落下位置, 使落刀平面与切割垫板平面垂直且两次落刀的刀口位置偏移不能超过10 μm。 参照落刀刀口位置,通过微操纵器调整电极尖端的位置, 然后落刀切割。 所有的操作都要在显微镜下进行(如图1B)。碳纤电极尖端到颈部最多保留30 μm的碳纤, 否则噪声较大。
图 1碳纤电极的制作设备
fig.1Setup for the preparation of carbon fiber electrode
a. The lab-made horizontal micropuller. The two figures show the microtip before and after the pulling. B. Cutting setups. It composes electrode holder, knife holder and stereomicroscope.
用碳纤电极进行如下实验测试:
1.碳纤电极性能测试
首先进行外观目测。 好的碳纤电极在显微镜下其尖端光洁平整, 无塑料毛刺或污染物。 然后进行电学特性测试。 EPC-9膜片箝放大器(HEKA公司, 德国),测试前状态设置为: 全细胞模式, 膜箝制电位0 mV, 快慢电容补偿为OFF, 增益在0.5～5 mV/pA之间, 滤波器1、 2分别为10、 1 kHz。碳纤电极安装到电极夹持器上, 通过3 mol/L KCl与放大器连通。 通过微操纵器将电极尖端缓慢浸入生理溶液中, 然后将加在电极上的膜箝制电位(Vcomm)阶跃至780 mV。 由于电极极化作用, 碳纤电极的检测电流(Iamp)波形会有一上冲。 好的电极由于其漏电流很小, 在十几秒到几十秒后电流波形会降至10 pA以内。 如果没有上冲, 说明电极尖端有污染; 如果电流不能恢复到10 pA以内, 可能是绝缘有问题。 另外电流噪声的峰峰值应在5 pA以内。 第3步,氧化性能测试。 向碳纤电极尖端吹加一定浓度的AA溶液。 在正常情况下, 会看到电流迅速上冲。 停止吹加后电流按指数衰减到起始处。 电流上冲的幅度与吹加的力度与溶液的浓度成正比。大致1 μmol/L 抗坏血酸如能产生10 pA左右的氧化电流便可使用, 见图2。
图2电极氧化性能测试
fig.2Test for oxidation property of CFE
electrode was dipped into ascorbic acid (AA) solutions of different concentrations. The steady state currents were used for depiction of dose-response curve. An amperometric spike induced by a puff of AA solution was illustrated in the insert.
