摘要：为探讨与学习记忆有关的一氧化氮 (nitric oxide, NO)信号转导通路, 本文用NO供体硝普钠 (sodium nitroprusside, SNP)或同时给予ADP-核糖基转移酶 (ADP-ribosyltransferase, ADPRT)抑制剂尼克酰胺(nicotinamide, NIC)侧脑室内注射, 观察其对大鼠学习记忆行为的影响。并用高效液相色谱法测定脑内ADPRT活性。结果表明, SNP (0.36 μg icv)使大鼠在被动回避反应的短时与长时记忆和在主动回避反应的学习记忆能力增强。首次发现ADPRT抑制剂NIC (1.5 mg icv)阻断SNP增强记忆的效应。还首次报告了学习训练或加上SNP (icv)使大鼠海马和大脑皮层的ADPRT活性显著升高。本文结果支持ADPRT可能是NO作用的一种靶分子的观点。 许多研究表明, 一氧化氮(nitric oxide, NO)与学习记忆有关［1］。本实验室曾报道内源性NO参与了学习记忆过程［2,3］。目前对与学习记忆相关的NO作用的“下游事件”(down stream events)的了解尚不够。已有资料说明, NO作用的主要靶分子为可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)。 NO使sGC活化后引起细胞内cGMP水平升高。在海马脑片上研究突触效应的长时程增强(LTP)与NO的关系亦支持此观点［4,5］。但文献上仍有不同意见。有些研究认为, 脑内可能存在独立于NO-sGC-cGMP以外的NO信号通路［6］。在离体实验上已发现, NO可激活腺苷二磷酸核糖基转移酶(ADP-ribosyltransferase,ADPRT), 催化某些蛋白质的核糖基化［7,8］。此反应可能参与LTP的产生。然而, 学习记忆过程是否存在NO刺激的ADP-核糖基化还不清楚。为此, 本工作通过大鼠的行为实验、NO供体硝普钠(sodium nitroprusside, SNP)和ADPRT抑制剂尼克酰胺(nicotinamide, NIC)的应用以及ADPRT活性测定等方法, 探讨与学习记忆有关的NO信号转导通路。实验用雌性成年Wistar大鼠(180～200 g), 分三批进行手术。用三溴乙醇麻醉, 按照脑立体定位图谱于右侧脑室内埋置内径0.5 mm的套管。术后1周开始行为实验。主要试剂有SNP, 购自北京制药工业研究所。NIC和辅酶Ⅰ(nicotinamide adenine din～ucl～eotide, NAD)为Sigma公司产品。对硝基苯亚甲基氨基胍 (P-nitrobenzylidine aminoguanidine, NBAG)为自行合成。手术后随机分组。第一批分3组观察SNP的效应。即脑室内注射生理盐水 (saline)组、 SNP 0.24 μg组和SNP 0.36 μg组。第二批分4组观察NIC对SNP效应的影响。即脑室内注射saline组、SNP (0.36 μg)+saline组、 SNP (0.36 μg)+NIC 1.1 mg组和SNP (0.36 μg)+NIC 1.5 mg组。第三批分3组, 即安静(naive)组、 脑室内注射saline组和脑室内注射SNP 0.36 μg组。对后2组施行主动回避反应训练。训练结束后3组同时处死, 取脑进行ADPRT活性测定。脑室注射的液量均为3 μl。

跳台被动回避反应和跳台主动回避反应的电击强度为0.18～0.20 mA。进行跳台被动回避反应训练时, 将动物放在反应箱中央的绝缘平台上, 当动物四爪全部下台时 (一般在1～2 s内),马上施于脚掌电击, 然后将动物取出, 间隔1 min后再重复上述训练1次。训练后立即向侧脑室内注射saline或SNP。于训练后2和24 h进行记忆测验。记录动物的下台潜伏期, 作为反映短时和长时记忆水平的指标 (下台后不予电击)。主动回避反应仍在相同的反应箱内进行。训练前1 h, 脑室注射saline、 SNP或SNP+NIC。训练时, 先将动物置于反应箱底部铜栅上, 以短声先出现5 s作为信号, 然后结合脚掌电击(最长10 s)。动物只有在信号出现期内上平台才为正确反应, 否则为错误反应。以达标(10次训练中有8次正确反应)所需训练次数, 错误反应总次数和每组动物中达标动物所占的百分率, 作为学习记忆能力的指标。全部训练进行3 d共40次(第1天10次, 第2、 3天各15次)。脑内ADPRT活性按照文献［9］的方法进行测定。应用Water996高效液相色谱仪 (美国Water公司)检测。测定前, 大鼠断头处死, 立即分离出海马和大脑皮层冻存。测定时各取100 g脑组织加入0.1 mol/L磷酸缓冲液制成匀浆。取500 μl匀浆加入25 mmol/L NAD (100 μl)、10 mmol/L NBAG (100 μl)和0.1 mol/L磷酸缓冲液(300 μl)混匀, 于30℃反应3 h。取200 μl反应液加入等量10％三氯乙酸中止反应。用10?000 r/min离心5 min, 取上清液过滤检测。根据NBAG减少量计算NBAG核糖基化的量, 用 μmol/g*h表示ADPRT活性。

统计学处理: 被动回避反应数据以中位数和四分位数表示。用Mann Whitney等级检验分析。其他数据以x±sx表示, 用方差分析并作两个均数比较的q检验(Newman Keuls法)。

实验结果如下:

1.侧脑室注射SNP对大鼠学习记忆的影响和 ADPRT 抑制剂 (NIC)的效应

通过第一批实验观察到, 侧脑室注射SNP 0.24 μg和0.36 μg, 对大鼠在跳台被动和主动回避反应的学习记忆有显著增强作用。尤以SNP 0.36 μg组更显著。

侧脑室注射SNP 0.36 μg组与Saline组比较, 其在被动回避反应的潜伏期显著延长。在主动回避反应中犯错误次数和达标所需训练次数都明显减少。全组动物达标率高。而两个剂量的NIC与SNP同时脑室注射完全阻断了SNP在两种行为反应中的效应。NIC 1.5 mg的作用更显著。

2.大鼠学习训练和脑室内注射SNP后脑内ADPRT活性的变化

大鼠进行主动回避反应训练后, 海马的ADPRT活性显著升高。训练前施加SNP脑室注射, 海马和大脑皮层的ADPRT活性显著高于安静组, 同时亦显著高于单纯学习训练组。

以上实验结果表明, 脑室内注射SNP在两种行为实验中都增强了大鼠的学习记忆能力。与前人的报告一样［10,11］, 这显然是SNP进入脑后产生NO所引起的效应。我们曾发现, 大鼠在学习记忆过程中脑内NO和NOS神经元出现上调［2,3］。这也与本文结果一致。有资料证实, NO参与海马CA1区LTP的表达［12］ (LTP被认为是记忆的突触模式)。Schuman等发现两种ADPRT抑制剂(NIC和Phylloqninone)能阻断海马脑片CA1区产生的LTP, 并提出NO影响海马LTP的靶分子可能是ADPRT［7］。本工作通过动物行为实验发现, ADPRT抑制剂NIC拮抗NO供体增强学习记忆的效应。此项结果提示, NO促进学习记忆与ADPRT活化有关。我们又进一步观察到, 学习训练的确使大鼠海马的ADPRT活性明显升高。再加上SNP脑室注射后, 海马和大脑皮层的ADPRT活性升高更显著。以上两项结果均属首次报道。可以设想, 在学习训练过程中, 内源性(脑内)NO的增加以及外源性给予NO供体都能使脑内ADPRT激活, 而抑制ADPRT活性则使学习记忆能力下降。因此我们认为, NO在学习记忆过程中发挥作用的靶分子之一可能是ADPRT。已知, ADPRT活化将催化从NAD转移ADP-核糖基到某些蛋白质特定的氨基酸残基上, 此反应称为ADP-核糖基化, 属蛋白质翻译后修饰。已有人报告, 脑内ADPRT的底物蛋白可能有Gs蛋白、GI/O蛋白和突触前膜蛋白GAP-43 (B-50)等等［7, 13］。有人检测出NO刺激海马几种突触蛋白的ADP-核糖基化, 其分子量为42～74 kD［14］。其中包括有类似Gsα蛋白和GAP-43。Huang等报告［10］, 海马齿状回内注射SNP增强大鼠在被动回避反应的长时记忆。实验结束后取齿状回组织进行的测定表明, 有几种蛋白的ADP-核糖基化减弱(意味其在体内ADP-核糖基化加强)。可究竟是哪些蛋白的ADP-核糖基化与NO在学习记忆中的信号转导直接有关, 仍不清楚。然而, 对LTP的研究以及本文的结果都支持在学习记忆过程中NO-ADPRT-蛋白ADP-核糖基化信号通路的存在。但此通路与NO-sGC-cGMP通路有无联系？NO激活某种靶分子是否取决于某些条件？这些问题尚待研究。

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张世仪,Corresponding author. Tel: 010-65296462; Fax: 010-65256546

张世仪(中国医学科学院基础医学研究所, 中国协和医科大学基础医学院, 北京 100005)

袁勃(中国医学科学院基础医学研究所, 中国协和医科大学基础医学院, 北京 100005)

李从德(湖北三峡大学医学院生理教研室, 宜昌 443003)

参考文献

［1］Schman EM, Medison DV. Nitric oxide and synaptic func～tion． Annu Rev Neurosci, 1994, 17: 153～183.

［2］Chen J, Zhang S, Zuo P et al. Memory related changes of nitric oxide synthase activity and nitrite level in rat brain. NeuroReport, 1997, 8: 1771～1774.

［3］Zhang S, Chen J, Wang S. Spatial learning and memory in～duced upregulation of nitric oxide-producing neurons in rat brain. Brain Res, 1998, 801: 101～106.

［4］Garthwaite J. Glutamate, nitric oxide and cell-cell signaling in the nervous system. Trends Neurosci, 1991, 14: 60～67.

［5］Zhuo M, Hu Y, Schultz C et al. Role of guanylyl cyclase and cGMP dependent protein kinase in long-term potentiation. Nature, 1994, 368: 635～639.

［6］Fang F (方芳), Cao Q (曹清), Song FJ (宋福津) et al. Evidence for involvement of NO/NOS-cGMP signal system in morphine dependence. Acta Physiol Sin (生理学报), 1999, 51 (2): 133～139 (in Chinese with English abstract)．

［7］Schuman EM, Meffert MK, Schulman H et al. An ADP-ribosyltransferase as a potential target for nitric oxide action in hippocampus long-term potentiation. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91: 11958～11962.

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