摘要：用微透析方法在麻醉麻痹大鼠的脊髓局部应用一氧化氮（NO）供体亚硝基铁氰化钠(sodium nitroprusside, SNP), 以碳丝微电极在腰膨大处行细胞外记录, 观察NO对机械刺激大鼠后足部皮肤引起的诱发反应和自发反应的影响。脊髓深层神经元透析1 μmol/L SNP, 10～20 min后, 非伤害性机械刺激诱发的反应增强, 伤害性机械刺激诱发的反应减弱; 透析20～30 min后, 伤害性和非伤害性机械刺激诱发的反应均减弱; 透析20 μmol/L SNP 7～15 min内伤害性和非伤害性机械刺激诱发的反应均降低。 1 μmol/L和20 μmol/L的SNP均在一定时间内使自发放电增强。结果提示: 不同浓度的NO对脊髓非伤害性和伤害性信息传递具有不同的作用; NO参与脊髓神经元抗伤害作用并促进其自发活动。越来越多的实验证实, NMDA-PKC-NO在致炎后痛觉过敏和痛觉超敏以及正常动物伤害性信息传递中均起作用[1]。 NO参与脊髓中枢敏感化的形成, 一氧化氮合酶 (NOS) 的选择性阻滞剂 7-NI 强烈抑制NMDA受体介导的“Wind-up”和后放[2]。脊髓内产生的NO对炎症和正常动物的“Wind-up”现象均起重要作用。NO对不同的脊髓细胞可引起兴奋和抑制两种不同的效应[3～5]。

Lin等[6]以前的实验发现, NO供体(SIN-1 hydrochloride)增强脊髓背角深层的广动力范围(WDR)神经元对机械刺激的诱发反应, 而不影响自发放电反应。Pehl等[7]在脊髓薄片上的细胞外记录表明, NO对脊髓背角的Ⅹ层绝大多数神经元的自发放电有兴奋作用。为进一步研究NO在脊髓感觉传入中的作用, 本实验以大鼠为对象, 用两种不同浓度的NO供体SNP进行局部微透析, 观察SNP对大鼠后足部感觉信息传导的影响。

１材料和方法

1.1手术 Wistar大鼠(首都医科大学动物科学部提供), 雌雄不拘(200～250 g), 雄性体重200～300g。 以2%的戊巴比妥钠(40～50mg/kg)腹腔注射麻醉, 行气管插管、颈静脉插管术, 行椎板切除术暴露腰膨大处脊髓节段。以氯化筒箭毒(0.1%, 0.2ml)麻痹, 接人工呼吸机, 固定于脑立体定位仪上, 脊髓暴露部位椎板以脊髓固定夹固定, 使动物呈悬吊状态, 以减小呼吸波动对脊髓稳定性的影响。用游丝镊撕开硬脊膜和蛛网膜, 以银球电极在脊髓背表面找到对足部触压刺激反应较多的区域后, 在记录部位局部软脊膜上开窗以利碳丝微电极刺入。用不锈钢针引导微透析管(表面涂以薄层硅胶, 留有3 mm空隙作为透析区, 在空气中干燥至少６ h, 一端以速干胶连于细不锈钢针备用, 微透析管的通透率为4～10%[8])横穿过脊髓, 未涂胶区留在脊髓内, 深度约平中央管。在脊髓暴露部位周围用琼脂糖筑槽, 灌温石蜡油保湿。休息1 h后, 用灌流泵经颈静脉插管给持续麻醉药(50 mg戊巴比妥钠、5 mg氯化筒箭毒溶于44 ml生理盐水中, 输液速度为1～2ml/h)。实验过程中注意保持大鼠呼气末CO2浓度为3～4%, 肛温为37±1℃。

1．2微透析给药 透析管经聚乙烯管(PE-10型)接微量注射机(WZS-50, 浙江医科大学医学仪器实验厂), 在寻找细胞、记录前对照和冲洗药物时通过微量注射机持续灌流生理盐水(去离子水配制, 储存于4～6℃冰箱中, 用前标定pH值至7.4, 以孔径为2.5μm的过滤器过滤, 灌流速度5 μl/min)。找到对机械刺激足部皮肤发生反应的细胞后, 将透析液换为SNP溶液(1 μmol/L或20 μmol/L, 用前临时配制, 用时注意避光)。微透析的作用范围为透析管周围半径750 μm, 不超过一个脊髓节段。 1．3刺激与记录 找到对按压皮肤发生反应的神经元后, 以标记笔标出对伤害性和非伤害性刺激反应最强的感受野。非伤害性刺激由一柔软毛刷垂直于感受野进行轻刷, 伤害性刺激由两个不锈钢动脉夹提供, 依靠动脉夹的弹性分别对感受野轻捏和重捏。刷作用于人产生触觉, 轻捏引起轻微痛觉, 重捏则导致较强烈的痛觉, 但不产生可见的损伤。实验中每次均在标定的同一感受野给予刺激。记录时先记自发反应10 s, 然后每间隔10 s依次给予刷、轻捏和重捏刺激, 每种刺激均持续10 s。根据神经元对不同机械刺激的反应, 将记录单位分为三类: 低阈值(LT)神经元(对刷刺激产生最大反应)、 WDR神经元(对三类刺激均起反应但对重捏刺激的反应最强)、高阈值(HT)神经元(仅对伤害性刺激发生反应)。

找到对上述刺激产生诱发反应的单位后, 记录前对照, 然后将透析液从生理盐水换为SNP溶液, 灌流10～20或20～30 min, 记录反应单位的自发放电和对三种机械刺激的反应, 再换回生理盐水冲洗, 每隔30～60 min重复记录, 直到诱发反应部分或完全地恢复到给药前水平。用单管碳丝微电极(2～6 MΩ)在微透析管头尾侧一个节段的范围内记录, 信号经探头输入放大器(MEZ-8201, 日本光电株式会社), 同时输入监听器(自制)、记忆示波器(VC-11日本光电株式会社), 并经Power Lab生物信号记录系统(澳大利亚AD Instrument Pty Ltd)输入计算机, 采集原始波形并记录频率的变化。

1．4结果分析 对每种反应均计算10 s的平均反应频率。因各记录单位实际反应频率相差太大, 数据均做标准化处理, 以对照的百分数表示神经元对药物反应的变化, 并将各自的对照值作为100%。结果用mean±SE表示, 对自发放电和三种刺激诱发反应给药前后的有关数据进行配对t检验, 显著性水准为0.05。

2结果

2.11 μmol/L SNP对大鼠脊髓神经元放电的影响

在7只大鼠脊髓背角513～867 μm深度记录到8个神经元反应, 因LT和HT神经元例数较少, 且给药前后对刺激的反应与相应深度的WDR神经元相比近似, 所以未做单独分析。

2.1.1对诱发放电的影响深层8个记录单位中有１例HT, １例LT和6例WDR神经元。包括1例HT神经元和5例WDR神经元在内的6例神经元, 透析1 μmol/L 的SNP后10～20 min, 对刷、轻捏和重捏的相对反应分别相当于给药前的127±8%、109±13%和76±9%, 其中对刷和重捏的反应分别显著地高和低于给药前(P＜0.05) 。

对其中5例(包括HT神经元)继续透析SNP, 观察反应变化。以给药10～20 min的反应频率作为对照, 用药20～30 min后, 对刷、轻捏和重捏的反应频率分别下降52±16%(P＞0.05)、 62±27% (P＞0.05)和46±12% (P＜0.01)。对重捏的反应与给药前相比有非常显著的意义 。 8例深层记录单位中有1例给药30 min后才开始记录, 它对三种刺激的反应均减弱, 对刷反应的减弱最明显, 但自发放电增强。

2.1.2对自发放电的影响 给药后10～30 min内, 自发放电频率增加到175±35%, 显著高于对照(P＜0.05)。微透析5 min后, 绝大多数深层单位都有阵发或持续性自发放电增强现象, 自发反应与诱发反应的增强无关, 但当诱发反应明显受抑时, 自发反应也同时被抑制。冲洗过程中自发反应先一过性增强, 然后减弱或平息。诱发反应恢复前自发放电均部分或全部恢复。

2.220 μmol/L SNP对大鼠脊髓神经元放电的影响

共记录4例WDR神经元, 给药后15 min内对刷、轻捏、重捏三种机械刺激的诱发反应分别降低55±18% (P＜0.05), 61±8% (P＜0.01)和68±11% (P＜0.05)。

给药后15 min内自发放电频率达188±35%, 与给药前相比有显著差异(P＜0.05) 。20～30 min时自发和诱发放电均明显降低, 诱发反应消失。冲洗后自发放电明显增强, 之后再次减弱; 冲洗1～3 h自发放电恢复后, 诱发放电开始恢复。

3讨论

外周注射福尔马林引起脊髓释放谷氨酸, 可增强脊髓对刺激的反射活动[9]。脊髓给予NMDA引起痛觉过敏[10,11], 而NMDA受体阻滞剂可取消福尔马林引起的行为学表现[12]。NMDA受体通道开启导致Ca2+内流, 激活Ca2+依赖的NOS, 以L-精氨酸为底物合成NO, NO作为逆行信使作用于突触前神经末梢发挥作用。NOS拮抗剂不能阻滞伤害性反射的发生, 但能阻滞伤害性反射的易化[13]。Wu等发现, 同样剂量的SNP (1 μmol/L)可以引起不同脊髓交感节前神经元兴奋性突触后电流[4]和抑制性突触后电流[5]。本实验的结果表明, 透析10～20 min后, 同样剂量的NO供体SNP对同一记录单位不同机械刺激诱发反应的影响不同,非伤害性刺激的诱发反应增强, 伤害性刺激的诱发反应减弱。

本实验中持续透析浓度为1 μmol/L 的SNP 20～30 min后, 脊髓背角神经元对三种机械刺激的反应频率均下降, 有的甚至低于给药前水平, 原因可能有二: (1)随着透析时间的延长, 记录点的药物浓度逐渐增高, 相对高浓度的SNP对伤害性和非伤害性机械刺激诱发的放电均产生抑制; (2)持续一定时间的自发放电使神经元逐渐耗竭。如透析的SNP浓度为20 μmol/L时, 记录单位的诱发反应被显著抑制的时间提前至15 min(最快7 min)内, 冲洗后部分诱发反应恢复的时间延长, 提示药物浓度在抑制产生的过程中起重要作用。冲洗过程中自发放电在一段时间内均有增强现象, 且用药浓度为2～20 mmol/L时增强更明显, 表明耗竭不起主要作用。1 μmol/L的SNP在透析20～30 min后, 记录单位对刷和轻捏的反应与用药前相比未见显著差异, 可能与数据的变异范围太大有关。

Lin 等[6 ]在脊髓给予NO供体SIN-1后背角深层WDR神经元对刷、压和捏的反应均增高, 而浅层WDR神经元的变化方向不一。他们所用的NO供体(SIN-1)浓度为10 μmol/L 。Pehl等[7]发现, NO对绝大多数Ⅹ层神经元的自发放电有兴奋作用, 而对Ⅰ/Ⅱ层的自发放电主要是抑制作用。他们所用的SNP浓度为10－4～1 μmol/L。本实验所用的浓度为1 μmol/L, 鉴于微透析管的通透率为4～10%, 实际有效浓度较Pehl等所用浓度低, 而Lin 等所用NO供体的有效浓度更低。据Pehl等[7]的实验, SNP的效应是同浓度 SIN-1 的100倍。如果将SNP的浓度换算为SIN-1的浓度, 则相当于lin等所用浓度的10和200倍, 提示本实验结果与Lin等<