摘要：实验在雄性Sprague-Dawley大鼠上进行。实验动物被随机分为对照组、应激组和应激+腹腔注射卡托普利(captopril)组。应激组大鼠每天给予电击足底结合噪声的应激刺激, 每日2次, 每次2 h, 连续15 d; 应激+ip captopril组大鼠在给予应激刺激期间, 经腹腔内注射captopril 50 mg/kg.d。实验结果观察到, 15 d后, 三组大鼠平均尾动脉收缩压分别为: 对照组16.32±0.55 kPa (n=7), 应激组19.75±1.0 kPa (n=8), 应激+ip captopril组17.69±1.07 kPa (n=8)。 应激+ip captopril组大鼠的尾动脉收缩压较对照组动物有显著升高(P＜0.05), 但又显著低于应激组大鼠(P＜0.05); 同时, 三组大鼠下丘脑组织中AVP-mRNA水平分别为: 对照组7?332.66±522.65 (n=6); 应激组12?990.33±1?533.58 (n=6), 应激+ip captopril组10?615.5±1?410.49 (n=6)。 应激+ip captopril组大鼠下丘脑组织中AVP-mRNA水平较对照组有显著升高(P＜0.001), 但又显著低于单纯应激组大鼠(P＜0.05)。统计结果显示: 各组大鼠下丘脑组织中AVP-mRNA水平与血压之间存在正相关关系(P＜0.001)。对照组大鼠在侧脑室注射(icv)选择性血管升压素(AVP) V1受体拮抗剂d(CH2)5Tyr(Me)AVP 0.3 μg后, 其平均动脉压(MBP)无显著改变, 而应激组和应激+ip captopril组大鼠在icv相同剂量的d(CH2)5Tyr(Me)AVP后, MBP均有显著降低, 但应激+ip captopril组大鼠MBP的降低幅度显著低于应激组大鼠。上述结果提示: 体内肾素-血管紧张素系统参与应激刺激引起大鼠血压升高过程, Ang Ⅱ的作用途径之一是通过刺激下丘脑AVP合成和释放增加, 进而引起血压升高。环境因素对机体影响的研究已越来越多地受到人们的重视, 其中现代生活节奏加快使人长期处于紧张状态所造成的慢性紧张应激刺激对机体心血管系统的影响已成为一个研究的热点。 目前临床上心血管疾病的发病率呈上升趋势, 慢性紧张应激刺激被认为是导致高血压、冠心病等心血管疾病发病率升高的重要环境因素[1]。 研究结果表明, 应激刺激会引起体内多种因素改变, 包括中枢神经肽 (如阿片肽)、 神经递质(如乙酰胆碱)及外周肾上腺皮质激素等, 这些变化均参与应激对机体心血管活动功能的影响。本实验室在过去几年中, 用噪声结合电刺激大鼠足底的方法造成应激性高血压大鼠模型[2]。 结果证明, 给予大鼠慢性电击足底结合噪声的应激刺激可导致动物血压出现持续性的升高。在此动物模型中, 林善锬等人曾观察到, 应激引起血压升高大鼠血浆中肾素及血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)活性均较对照动物有显著升高[3]。 我们在过去的研究中还曾观察到, 由下丘脑合成并释放的血管升压素(vasopressin, AVP)参与应激引起大鼠血压升高过程[4]。 在体内, Ang Ⅱ和AVP之间有着密切的相互作用[5], 因此, 体内Ang Ⅱ在应激之后的改变是否参与应激刺激引起大鼠血压升高过程, 是否与AVP的改变存在相互作用, 即成为本实验研究的目的。

１材料和方法

1.1实验动物及处理 动物全部采用雄性SD大鼠, 由上海医科大学实验动物部提供。动物随机分为对照组、刺激组和刺激+腹腔内注射卡托普利(ip captopril)组。刺激组动物每天给予电击足底结合噪声的刺激, 每天2次, 每次2 h, 连续刺激15 d,刺激方式和参数与我们过去报道的相同[4]。刺激+ip captopril组动物在给予应激刺激期间, 每天经腹腔内注射captopril (50 mg/kg); 对照组动物不给予任何刺激, 三组大鼠在相同条件下饲养。

1.2大鼠平均动脉压 (MBP) 记录和侧脑室给药 将大鼠用氨基甲酸乙酯(700 mg/kg)和α-氯醛糖(35 mg/kg)混合麻醉剂经腹腔注射麻醉后, 分离一侧颈总动脉作动脉插管, 用于记录大鼠血压及心率。于前囟后1 mm, 旁开1.5 mm处, 钻一直径约1 mm的小孔,按Paxions和Walson氏图谱, 作侧脑室插管用于脑室内给药。

1.3用核酸斑点杂交技术观察下丘脑AVP mRNA水平 通过核酸斑点杂交观察下丘脑AVP mRNA技术沿用我室过去所采用的技术[6,7]。以26个碱基长的寡核苷酸作为探针, 探针用异羟基洋地黄毒甙(DIG)进行3′末端拖尾标记, 杂交反应结果用发光反应检测方法检测。用HP Vectra PC (80286)图像处理系统对杂交信号进行光密度扫描, 求出各斑点的平均光密度和面积, 用平均光密度与面积的乘积代表样品中AVP mRNA的相对含量。

1.4大鼠尾动脉收缩压测定 在动物处于清醒状态下用尾套法测尾动脉收缩压, 每周2～3次, 每次测量均在应激刺激停止2 h后进行, 以消除急性应激对动物血压的影响。

1.5数据处理 全部数据用均数±标准差表示, 用方差分析统计方法分析各组间是否有显著差异。

2结果

2.1腹腔内注射captopril后应激刺激对大鼠尾动脉收缩压的影响

给予动物电击足底结合噪声的应激刺激时, 大鼠出现呼吸加深加快、直立、逃避等一系列紧张表现。经过多次刺激后, 仅给予噪声刺激动物也会出现上述一系列反应。15 d后, 应激组大鼠尾动脉收缩压为19.75±1.0 kPa (n=8), 较对照组有显著升高(16.32±0.55 kPa, n=7, P＜0.05)。应激+ip captopril组大鼠尾动脉收缩压为17.69±1.07 kPa (n=8), 显著低于单纯应激组动物(P＜ 0.05), 又显著高于对照组动物(P＜0.05)。

2.2腹腔内注射captopril后应激刺激对大鼠下丘脑组织中AVP-mRNA水平的影响

实验结果观察到, 单纯应激组大鼠在给予电击足底结合噪声的应激刺激15 d后, 其下丘脑组织中AVP-mRNA水平高于对照组动物(对照组: 7?332.66±522.65, n=6; 单纯应激组: 12?990.33±1?533.58, n=6), 并在统计学上有极显著意义(P＜0.001)。而应激+ip captopril组大鼠下丘脑组织AVP-mRNA水平为10?615.5±1?410.49 (n=6), 显著高于对照组动物(P＜0.001), 但较单纯应激组有显著降低(P＜0.05) 。

2.3各组大鼠下丘脑组织中AVP-mRNA水平与血压之间的相关性分析

用直线相关分析方法对各组大鼠下丘脑组织中AVP-mRNA水平与尾动脉收缩压水平进行相关分析, 结果显示, 二者存在正相关关系, 并在统计学上有显著意义(P＜0.001)。

2. 4侧脑室注射AVP V1受体阻断剂d(CH2)5Tyr(Me)AVP对平均动脉压的影响

实验观察到: 对照组大鼠在侧脑室内注射(icv)选择性AVP V1受体阻断剂d(CH2)5Tyr(Me)AVP 0.3 μg后, 动物MBP无明显改变, 应激组大鼠在icv注射相同剂量d(CH2)5Tyr(Me)AVP后, MBP逐渐降低, 降压效应持续约2 h, 给药后45 min时降压作用最为显著, MBP在给药前17.89±1.58 kPa (n=5)的水平上平均下降4.75±1.68 kPa, 给药前后的MBP在统计学上有显著差异(P＜0.05)。应激+ip captopril组大鼠经icv注射 d(CH2)5Tyr(Me)AVP 0.3 μg后, MBP也出现显著降低(P＜0.05)。降压反应在给药后45 min时最为显著, 在给药前15.41±1.64 kPa的基础上平均下降2.67±0.68 kPa, 但应激+ip captopril组大鼠经icv注射d(CH2)5Tyr(Me)AVP后的降压反应显著低于单纯应激组大鼠。

3讨论

3.1内源性血管紧张素Ⅱ在应激刺激引起大鼠血压升高过程中的作用

在连续15 d的应激刺激后, 应激组大鼠血压较对照组大鼠有显著升高, 并在统计学上有显著意义, 这与我们以前的报道一致, 提示慢性应激刺激可引起大鼠血压持续升高。林善锬等人曾观察到, 给予大鼠电击足底结合噪声的应激刺激后, 大鼠血浆肾素活性及Ang Ⅱ 浓度都高于正常。这一结果提示, 电击足底结合噪声的紧张应激刺激_谝鸫笫笱股叩耐? 还激活了体内肾素-血管紧张素系统[3]。本实验在给予大鼠应激刺激期间, 经腹腔内注射血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂captopril, 阻断内源性Ang Ⅱ 生成后, 虽然应激刺激仍可使大鼠MBP出现升高, 但其升高程度较单纯应激组已有显著降低。这一结果提示, 慢性应激刺激引起的内源性肾素-血管紧张素系统激活参与应激引起大鼠血压升高过程, 并可能在高血压的维持中起作用。

3.2内源性血管紧张素Ⅱ参与应激引起大鼠血压升高过程的机制

我室在过去的研究中曾观察到, 体内有多种因素参与慢性应激刺激引起大鼠血压出现持续升高[8], 其中由下丘脑视上核(SON)和室旁核(PVN)合成并释放的AVP也参与这一过程。应激刺激可引起AVP合成和释放增加, AVP主要通过作用于中枢V1受体参与应激致血压升高过程[4]。在本实验中, 我们观察到应激之后大鼠下丘脑组织中AVP-mRNA水平较对照组动物有显著升高, 通过中枢给予选择性AVP V1受体阻断剂d(CH2)5Tyr(Me)AVP后, 可使升高的MBP有显著降低。这些结果再次证实AVP通过作用于中枢V1受体参与慢性应激引起大鼠血压升高过程。从应激之后下丘脑内AVP-mRNA与动物血压水平相关分析结果来看, 二者间的相关关系在统计学上有显著意义, 提示给予应激刺激之后动物血压升高水平可能与下丘脑内AVP合成与释放增加程度有关。

Ang Ⅱ不能通过血脑屏障, 但通过作用于脑室周围器官, 如终板血管器(OVLT)、穹窿下器(SFO)等, 可使下丘脑内AVP释放增加[9]。我们过去也曾报道, 脑室内给予Ang Ⅱ 可使下丘脑内AVP-mRNA水平出现显著升高[6]。我们观察到大鼠在给予应激刺激期间, 通过腹腔内注射captopril, 阻断内源性Ang Ⅱ合成后, 应激引起的血压升高反应较单纯应激组有显著降低, 同时, 其下丘脑组织中AVP-mRNA水平、中枢给予选择性V1受体拮抗剂所引起的降压反应较单纯应激组也有显著降低。因此我们推测, 应激之后体内肾素-血管紧张素系统激活, 血浆Ang Ⅱ 浓度升高, 通过使下丘脑AVP合成和释放增加作用于中枢V1受体, 是Ang Ⅱ 参与应激刺激引起动物血压升高反应的途径之一。当然, 由于Ang Ⅱ 在体内参与血压调