生理学报 1999年第5期第51卷

谈世进；上海市第六人民医院心内科；上海；200233；潘敬运；詹澄扬；朱晓南；广州中山医科大学生理教研室；广州；510089谈世进；潘敬运；詹澄扬；朱晓南

关键词：血管紧张素Ⅱ；saralasin；nicardipine；c-fos mRNA；蛋白质合成

摘要：本实验在培养新生大鼠心肌细胞上, 探讨血管紧张素Ⅱ对心肌细胞c-fos mRNA表达和蛋白质合成的影响。结果显示, 血管紧张素Ⅱ能诱导c-fos mRNA的表达, 增加蛋白质含量, 并呈量-效关系; 还能加速 ～³H-亮氨酸的掺入速度。上述这些作用可被血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂saralasin所阻断,提示这些作用是受体介导的。血管紧张素Ⅱ诱导c-fos mRNA的表达亦可被钙通道阻滞剂nicardipine所阻断。

分子生物学和生物化学技术证实,心脏本身可合成血管紧张素原^［1］、肾素^［2］、血管紧张素转换酶mRNA^［3］,在大鼠心肌中检测出血管紧张素Ⅱ结合位点^［4］。有实验证实, 用血管紧张素Ⅱ灌流大鼠可引起左心室肥厚,这种肥厚作用可被AT₁受体拮抗剂所阻断, 但不被转换酶抑制剂或血管扩张剂所阻断^［5］;Baker等^［6］在鸡胚心肌细胞中,丁小凌等^［7］在培养乳鼠心肌细胞中均观察到血管紧张素Ⅱ可引起心肌细胞肥厚。

血管紧张素Ⅱ促进心肌细胞肥厚的机制尚未完全阐明,可能与诱导原癌基因表达增强有关。我们曾观察到^［8］,用血管紧张素Ⅱ灌流成年大鼠心脏可明显诱导左心室原癌基因c-fos和c-myc mRNA的表达。心肌组织是由心肌细胞和非心肌细胞所组成,那么血管紧张素Ⅱ诱导左心室c-fos mRNA的表达是来源于心肌细胞, 还是非心肌细胞？本实验用培养新生大鼠心肌细胞探讨: （1）血管紧张素Ⅱ是否可诱导心肌细胞原癌基因c-fos mRNA的表达; （2）钙通道阻滞剂在血管紧张素Ⅱ诱导c-fos mRNA的表达中的作用;（3）血管紧张素Ⅱ是否可促进心肌细胞蛋白质的合成。

1材料与方法

1.1材料血管紧张素Ⅱ, saralasin （［Sar¹, I Ie⁸］angiotensin Ⅱ）, 异硫氰酸胍, 转铁蛋白, 牛血清白蛋白,十二烷基肌氨酸钠均购自Sigma公司; M199培养基购自Gibco公司; 胰蛋白酶购自Difco公司;5-溴脱氧尿嘧啶核苷（Brdu）是Serva公司产品; SDS,缺口翻译试剂盒购自 Pharmacia 公司; 尼龙膜为 Amershan 公司产品; ［α-³²P］ dCTP是北京亚辉生物工程公司产品; 含Ecor I酶切位点的大鼠c-fos插入片段的质粒购于ATCC公司;³H-亮氨酸: 中国科学院上海核技术开发公司产品,放射性比活度为2035 GBq/mmol。其余试剂均是国产分析纯产品。

1.2心肌细胞培养取1～3 d龄Sprague-Dawley大鼠, 在无菌条件下开胸取出心室, 在4℃ Hanks液中切成1 mm³大小的碎块,用含0.125%胰蛋白酶的无钙、镁的Hanks溶液消化, 离心弃上清, 重复消化2次, 收集细胞, 加含10%小牛血清M199培养液, 装入100 ml培养瓶中, 每瓶4 ml。在37℃, 5%CO₂培养箱中差速贴壁培养2h, 除去非心肌细胞, 吸出未贴壁的心肌细胞,配成1×10⁶ /ml细胞浓度, 分装入25 ml培养瓶中。在最初48h, 培养液中加入0.1 mmol/L Brdu,抑制非心肌细胞增殖。24 h后换成无血清培养液(含M199培养液、 胰岛素10μg/ml、 转铁蛋白10μg/ml、 维生素C100μg/L、维生素B₁₂ 1.5 μmol/L)继续培养48h, 然后分别加入各种试剂继续培养。每8h换液1次,尽量保持各试剂浓度不变。最后, 收集细胞,进行测定。

1.3蛋白质含量测定用Lowry′s法测定心肌细胞(2×10⁵/ml)蛋白质含量^［9］。

1.4³H-亮氨酸掺入量的测定用³H-亮氨酸掺入量来反映心肌细胞蛋白质合成速率。将2×10⁵个细胞/ml,接种到24孔培养板中, 每孔1 ml, 培养2d后换为无血清培养液, 继续培养24 h。 然后每孔分别加入各种试剂和18.5 kBq ³H-亮氨酸25 μl, 24 h后用多头收集器将细胞样品收集到玻璃纤维滤膜上。用10%三氯醋酸破碎细胞并固定,用蒸馏水反复冲洗, 以除去游离的同位素标记物。烘干滤膜, 放入闪烁瓶中, 加入闪烁液5 ml,液体闪烁计数器(Backman公司)测定放射量。

1.5总RNA的提取按Chomezynski等^［10］描述的方法提取心肌细胞(5×10⁶个细胞/ml)的总RNA,以260和280nm紫外光吸收率测定RNA的浓度和纯度。

1.6c-fos探针的标记和斑点杂交用我们以前报道的方法制备 c-fos原癌基因探针。用切口翻译试剂盒和［α-³²P］dCTP标记 c-fos片段,探针的放射比活度为1.2×10⁸cpm/μg,标记率为35%。GAPDH寡核苷酸的标记按Gustafson等的方法^［11］。GAPDH寡核苷酸为5′-ACCATGAAGTTGAGGTCAATG-3′^［14］,由加拿大Genda公司合成。将加热变性后的RNA(8 μg)经加样孔点在尼龙膜上(Amershan产品)。将尼龙膜放入含预杂交液的塑料袋中,在42℃水浴中振荡6～12h, 然后将已标记的c-fos探针加至上述含预杂交液的塑料袋中, 在42℃水浴中反应20～24 h。取出已预杂的尼龙膜,放入2×SSC+0.1% SDS液中, 室温下漂洗3次, 每次1 h。用保鲜膜包好, 进行放射自显影。然后除去尼龙膜上的探针,用GAPDH探针再杂交作内标。通过图像处理分析系统(IBAS, 德国)测量各斑点的平均光密度。 c-fos mRNA表示的相对光密度用GAPDH mRNA的平均光密度来标准化。

1.7统计分析除特别说明,每组实验重复3次(n=3)。所有数据均用均值±标准误(x±S _x）表示。 两因素间的相关关系用直线回归分析,多组间比较用方差分析。

2结果

2.1血管紧张素Ⅱ诱导 c-fos原癌基因的表达

2.1.1c-fos基因表达的时间过程在培养液中加入血管紧张素Ⅱ(10^－7 mol/L),迅速诱导心肌细胞c-fos原癌基因的表达, c-fos mRNA水平在30 min时表达达到高峰, 为对照的3倍; 此后, 表达逐步降低, 240 min后恢复至对照水平(图1)。

图1斑点杂交分析(上)和直方图(下)显示血管紧张素Ⅱ诱导新生大鼠心肌细胞c-fos mRNA表达的时间过程

Fig.1Dot-blot analysis (top) and his～to～gram (bottom) showing the time course of angiotensin Ⅱ-induced c-fos mRNA expression in cultured neonatal myocardial cells

^**P＜0.01;^*P＜0.05, compared with control．

2.1.2Saralasin的作用在培养液中加入血管紧张素Ⅱ(10^－7mol/L)作用30 min, c-fos mRNA的表达显著增加, 为对照组的2.25倍(P＜0.01); 预先加入saralasin (10^－7mol/L)作用30 min, 可完全阻断血管紧张素Ⅱ的作用; saralasin本身对c-fos 基因的表达无明显的影响(图2)。

图2斑点杂交分析(上)和直方图(下)显示saralasin对血管紧张素Ⅱ诱导新生大鼠心肌细胞c-fos mRNA表达的影响

Fig.2Dot-blot analysis (top) and histogram (bottom) showing the effects of saralasin on angiotensin Ⅱ-induced c-fos mRNA expression in cultured neonatal myocardial cells

^**P＜0.01 compared with control.

2.1.3钙通道阻滞剂nicardipine的作用预先在培养液中加入nicardipine (10^－8mol/L)作用30 min, 再加入血管紧张素Ⅱ(10^－7mol/L)刺激心肌细胞30 min, c-fos基因表达与对照无明显差异(P＞0.05);单独nicardipine对c-fos的表达无明显的影响(图3)。

图3斑点杂交分析(上)和直方图(下)显示nicardipine对血管紧张素Ⅱ诱导新生大鼠心肌细胞c-fos mRNA表达的影响

Fig.3Dot-blot analysis(top)and histogram(bottom)showing the effects of nicardipine on angiotensin Ⅱ-induced c-fos mRNA expression in cultured neonatal myocardial cells^**P＜0.01 compared with control.

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