摘要：采用微量注射、微透析、高效液相色谱-荧光测定等技术和方法, 观察和分析了血管紧张素-(1-7)[Ang-(1-7)]在延髓头端腹外侧(RVLM)与氨基酸类递质释放之间的关系。在麻醉大鼠RVLM注射Ang-(1-7)可引起血压升高,同时伴RVLM兴奋性氨基酸(EAA)释放增多; 在RVLM注射Ang-(1-7)选择性受体拮抗剂Ang779可引起血压降低, 同时伴RVLM EAA释放减少和抑制性氨基酸(IAA)释放增多。Ang-(1-7)的升压作用和Ang779的降压作用均可被相应的氨基酸受体拮抗剂部分阻断。结果提示, ang-(1-7)在RVLM的升压效应可能部分是通过EAA释放增多所致; 而Ang779在RVLM的降压效应可能部分是通过EAA释放减少、IAA释放增多所致。长期以来, 血管紧张素-(1-7)[angiotensin-(1-7), Ang-(1-7)]一直被认为是血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ, AngⅡ)的无生物活性代谢产物。近年来的研究表明, ang-(1-7)在心血管功能调节中起重要作用, 是血管紧张素系统中一种新的有活性的激素。在中枢神经系统, Ang-(1-7) 的作用常常与AngⅡ相似[1,2]。实验证明, 延髓头端腹外侧(rostral ventrolateral medulla, RVLM) 是调节心血管活动的重要部位[3,4],此处存在多种氨基酸类神经递质。AngⅡ在RVLM 可以通过氨基酸类递质影响心血管活动[5~7], 而Ang(1-7)的作用是否也与氨基酸类递质有联系,至今未见报道。本工作采用微量注射、微透析、高效液相色谱-荧光测定等技术和方法, 旨在观察: (1) 外源性Ang-(1-7)及其拮抗剂Ang779注入RVLM的心血管效应; (2)外源性Ang-(1-7)、Ang779注入RVLM时该区氨基酸类递质释放的变化; (3)在RVLM, Ang-(1-7)的升压作用和Ang779的降压作用能否被相应的氨基酸受体拮抗剂部分阻断。

１材料和方法

1.1动物处理实验用雄性Wistar大鼠(260~320 g)。用氨基甲酸乙酯(700 mg/kg)和α-氯醛糖(35 mg/kg)混合腹腔麻醉, 行气管插管,分离左侧股动脉。将充满0.1%肝素钠生理盐水的聚乙烯塑料导管插入其向心端, 通过三通管接口连接血压换能器记录平均动脉压(mean arterial pressure, MAP)和心率, 并将其描记于Polygraph System (Nihon Kohden, Japan)。肛温维持在37℃左右。

1.2中枢RVLM核团的微量注射及微透析方法大鼠取仰卧位, 头部固定在立体定位仪上。分离颈部两侧肌肉, 用线结扎分别牵引到立体定位仪两侧, 暴露枕骨基底部,咬除右侧部分枕骨, 可看见右侧Ⅻ脑神经。 RVLM定位在Ⅻ脑神经头侧第一分支前0.6~1.0 mm, 中线旁开1.7~1.9 mm, 腹侧表面下0.5~0.8 mm。 外套管及微量注射内套管均用不锈钢管制成。将外径为0.4、0.85 mm的两根钢管用氯仿粘于有机玻璃支架上, 一根垂直, 一根倾斜架在立体定位仪上,作导向用, 不插入脑组织。将外径为0.2 mm的注射管经0.4 mm导向管插入脑内, 20 s内匀速注射完0.1 μl (氨基酸受体拮抗剂) 或0.2 μl [Ang-(1-7), ang779]; 另将微透析探头(MI-BDP-1-8-03, EICOM公司, Japan)经0.85 mm导向管插入脑内, 下端与微量注射内套管下端相邻,上端入口管通过塑料导管与微透析泵(MD-0100, Bioanalytical Systems, USA)相连。 透析液为人工脑脊液(cerebrospinal fluid, CSF, pH 7.4, 浓度mmol/L: NaCl 130, KCl 2.99, CaCl2 0.98, MgCl2·6H2O 0.80, naHCO3 25, Na2HPO4·12H2O 0.039, NaH2PO4·2H2O 0.46), 流速2 μl /min。所用药物用人工CSF配成,并调整其pH为7.4。

1.3RVLM区的组织学鉴定在RVLM注药完毕后, 在原注射点注射2％滂胺天蓝0.1 μl。处死动物后取出脑组织, 将脑组织固定在10％福尔马林溶液中, 4~7 d后用LEICA (CM1900)冷冻切片机切成50 μm系列冠状切片, 以中性红染色, 参照Paxions和Watson图谱确定注射和微透析部位。

1.4高效液相色谱-荧光检测法测定氨基酸色谱仪(System Gold GP-Ⅱ型)与荧光检测器(157型)为Beckman公司产品。色谱柱为C18, ultrasphere ODS反相柱, 4.6 mm×25 cm (颗粒5 μm), 前端接预柱4.6×4.5 cm (颗粒10 μm)。流动相为0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.00~6.25) 52％, 甲醇46％, 四氢呋喃2％, 流速1 ml/min。进样20 μl。室温19~23℃。荧光检测器的RFU为0.01,激发波长280 nm, 发射波长340 nm。

1.5统计分析实验数据以mean±SEM表示, 用方差分析作统计学处理。P＜0.05表示差别有统计学意义。

1. 6药物来源Ang-(1-7)和氨基酸受体拮抗剂为美国Sigma 公司产品, Ang779为美国Bachem公产品。

2结果

2.1RVLM微量注射Ang-(1-7)及其拮抗剂对血压和心率的影响

将Ang-(1-7) 100 pmol/0.2 μl注射于大鼠右侧RVLM (n=8), 可引起MAP升高, 由给药前的12.49±0.47 kPa升高为15.57±0.51 kPa(P＜0.01); 心率(heart rate, HR)加快, 由给药前的387±23 bpm升高为396±25 bpm (P＞0.05)。将Ang-(1-7)的选择性受体拮抗剂(D-Ala7)-Ang-(1-7)(Ang779) 200 pmol/0.2 μl注射到右侧RVLM (n=9), 可见MAP明显下降,由给药前的12.73±0.3下降至给药后的10.12±0.4 kPa (P＜0.01); 但HR下降不明显。在大鼠RVLM注射等容量CSF后 (n=8), mAP和HR均无明显变化。将注射Ang-(1-7)或Ang779组与注射CSF组的数据相比较, 组间MAP的差别有显著意义, 而HR的差别无显著意义。结果提示,在RVLM可能存在着内源性Ang-(1-7), 且在正常情况下有紧张性升压作用。

另外取6只大鼠, 将CSF、100 pmol/0.2 μl的Ang-(1-7)或200 pmol/0.2 μl Ang779注射到右侧RVLM区以外部位(如延髓网状巨细胞核,下橄榄背核), 均不能引起MAP (P＞0.05)上升。

2.2RVLM微量注射 Ang-(1-7) 对该区氨基酸类递质释放的影响

在RVLM微量注射的同时进行微透析, 透析速度为2 μl/min, 收集透析液10 min (20 μl)为1管。给药前收集1管作为对照, 给药后收集2管,观察氨基酸类递质释放量的变化。在10只大鼠的RVLM注射Ang-(1-7)后第一个10 min, 可见兴奋性氨基酸(excitatory amino acid, eAA)谷氨酸(glutamate,Glu) 释放量明显增多(P＜0.05); 第二个10 min内仍保持较高水平。而在12只大鼠RVLM注射Ang779后第一个10 min内, 可见Glu释放量明显减少(P＜0.05), 抑制性氨基酸 (inhibitory amino acid, IAA) 甘氨酸 (glycine, gly)、牛磺酸(taurine, Tau)和γ-氨基丁酸 (γ-aminobutyric acid, GABA) 释放量明显增多(P＜0.05) ,第二个10 min内基本恢复正常(P＞0.05)。将注射Ang-(1-7)或Ang779组与注射CSF组作比较, 组间均有显著性差别。结果提示, Ang-(1-7)、Ang779在RVLM对血压的调节可能与氨基酸类递质释放有关。

2.3氨基酸受体拮抗剂对RVLM Ang-(1-7)、Ang779 调节血压的影响

在8只大鼠的RVLM注射2.7 nmol/0.1 μl NMDA受体拮抗剂犬尿烯酸(kynurenic acid, kyna)后4 min, 再在同一部位给予Ang-(1-7)100 pmol/0.2 μl, MAP未见明显升高, 其升高最大值为1.3±0.25 kPa (P＞0.05)。于上述同样条件下, 在RVLM先注射0.1μl CSF后再给予Ang-(1-7) 100 pmol/0.2 μl, 仍可见MAP明显升高, 其升高最大值为3.7±0.34 kPa(P＜0.05)。两者作比较, 组间差别有显著性意义。结果表明, Ang-(1-7)升压作用可被 NMDA受体拮抗剂Kyna部分阻断。

在RVLM先注射Gly受体拮抗剂士的宁(strychnine, Stry) 1 nmol/0.1 μl (n=8), 或GABA受体拮抗剂荷包牡丹碱(bicuculline, bicu) 0.5 nmol/0.1 μl (n=7) 后4 min, 再在同一部位给予Ang779 200 pmol/0.2 μl,可见MAP下降不明显(P＞0.05), 下降最低值分别为－1.01±0.18 kPa, －1.22±0.17 kPa。以上述同样条件在RVLM先注射0.1 μl cSF后再给予Ang779 200 pmol/0.2 μl, 仍可见MAP明显降低, 下降最低值为－3.3±0.3 kPa (P＜0.05)。两者作比较,组间差别有显著性意义。说明IAA受体拮抗剂可部分阻断Ang779降低血压的作用。

3讨论

许多证据显示, RVLM是调节心血管活动的重要交感整合中枢[3,4]。在RVLM存在的多种递质对心血管活动起重要调节作用,如乙酰胆碱、去甲肾上腺素、氨基酸、血管紧张素[8]等。很多调节信息在RVLM的心血管运动神经元进行整合, 最终传向脊髓中间外侧柱的交感节前神经元。

一般认为, 在RVLM血管紧张素的作用是由AngⅡ与AT1 受体结合完成的[9]。但Chappell等人[10]在1989年观察到在RVLM 存在着Ang-(1-7),且Ang-(1-7) 的浓度与AngⅡ一样高。Silva等人[11]认为, Ang-(1-7) 在RVLM 也可以引起血压升高,并通过与以往已经发现的血管紧张素受体不同的受体(有人称之AT5受体)来完成[12]。因为在RVLM微量注射Ang-(1-7)引起的升压反应不受AT1受体拮抗剂DuP753或AT2 受体拮抗剂CGP42112A影响, 但可被Ang-(1-7) 选择性拮抗剂Ang779完全阻断。相反, angⅡ在RVLM引起的升压反应可完全被相同剂量的DuP753阻断, 而不受Ang779或CGP42112A的影响。Hirooka等报道, Ang-(1-7)可能是在RVLM调节正常心血管活动的真正内源性物质。因为向麻醉动物RVLM直接注射Ang779有降压作用, 而AT1受体拮抗剂DuP753, 或AT2受体拮抗剂CGP42112A 、PD123319无降压作用[9,12~14]。以前认为, 在RVLM, AngⅡ在正常情况下有紧张性作用,是基于给予非特异血管紧张素拮抗剂Sar1-Thr8-AngⅡ后可引起降压作用, 而 Ang-(1-7) 的作用也可被它阻断, 说明正常情况下在RVLM起紧张性作用的可能是Ang-(1-7)。但Mikami[5-7]等人则仍认为,在RVLM, AngⅡ在正常时有紧张性升压作用, 因为他们向动物RVLM注射AT1受体选择性拮抗剂ＣＶ11974有降压作用。1996年, Lima[14]报道,在麻醉动物RVLM微量注射Ang I引起的升压反应不受DuP753的影响, 而Ang779能够明显降低Ang I的升压反应, 提示Ang I在RVLM可能优先转化为Ang-(1-7