摘要：利用新生大鼠心室成纤维细胞条件培养液孵育心肌细胞,证实成纤维细胞条件培养液能明显增大心肌细胞的表面积,增加心肌细胞的蛋白含量和［3H］-亮氨酸(［3H］-Leu)的掺入, 上述作用以第3天的条件培养液作用最强,具有剂量依赖性。ETA受体拮抗剂BQ123能部分阻断成纤维细胞条件培养液促进心肌细胞肥大的作用, 而AT1受体拮抗剂CV11974和α-肾上腺素受体拮抗剂regitin却无此效果。结果提示: 成纤维细胞条件培养液中含有促使心肌细胞肥大的物质, 这些物质可能是内皮素(ET-1)等。 百日咳毒素(PTX)和staurosporine也能部分阻断成纤维细胞条件培养液促进心肌细胞肥大作用,表明培养液的促肥大作用可能与PTX敏感的G蛋白及PKC有关。心脏由心肌细胞和非心肌细胞组成。 非心肌细胞包括成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞等, 其中成纤维细胞占绝大部分。 心肌细胞收缩能力强,出生后无分化能力, 占心脏细胞总数的30%; 而非心肌细胞中除平滑肌细胞外均无收缩能力, 但有很强的分化能力, 占心脏细胞的70%。 过去,人们一直认为非心肌细胞对心肌细胞仅具有结构上的支持、保护作用。 近年来, 人们逐渐了解到非心肌细胞还具有自分泌和旁分泌功能, 能产生某些可溶性物质,影响心肌细胞的结构和生理功能, 对心脏具有重塑作用［1～4］。 我们利用新生大鼠心脏成纤维细胞无血清条件培养液(fibroblast conditioned growth medium, FCGM), 探讨成纤维细胞是否分泌活性物质以影响心肌细胞结构和功能, 并研究这些物质作用可能的信号传导途径。

1材料和方法

1.1心肌细胞和心脏成纤维细胞的分离和培养取1～3 d龄的SD大鼠(雌雄不限, 中山医科大学实验动物中心提供), 在无菌条件下开胸剪取心室肌。在胰蛋白酶消化液消化后, 加入含10%血清的DMEM培养液制成细胞悬液, 分种于25 ml玻璃培养瓶中, 置于37℃、5% CO2培养箱内,根据心肌细胞和成纤维细胞贴壁时间的不同, 采用差速贴壁1 h, 分别获得心肌细胞和成纤维细胞。 培养的前48 h, 在心肌细胞的培养液中加入Brdu0.1 mmol/L, 以抑制成纤维细胞的增殖。

1.2成纤维细胞条件培养液(FCGM)的获取将成纤维细胞传代, 接种于50 ml的玻璃培养瓶至融合状态, 在含1%血清DMEM培养液中孵育24 h,然后置入8 ml/瓶的无血清培养液(DMEM、胰岛素10 μg/ml、转铁蛋白10 μg/ml、Vit C 100 μmol/L、Vit B12 1.5μmol/L、青霉素100 U/ml、链霉素100 μg/ml)。 同一批成纤维细胞, 在第3天收集全部条件培养液后, 再加入新鲜的无血清条件培养液8 ml,培养48 h (第5天)后收集全部条件培养液。 以此类推, 在第7天和第9天分别收集成纤维细胞的条件培养液, 用0.45 μm 滤膜过滤, 贮于－20℃,待实验时使用。 传代后的成纤维细胞采用α-actin免疫细胞化学染色鉴别, 纯度达95%。

1.3心肌细胞表面积测定贴壁生长的心肌细胞被消化脱落后, 用图像处理系统测定心肌细胞的周径和表面积, 每瓶测5个视野, 每个视野测15～20个细胞,取其平均值。

1.4心肌细胞蛋白质测定差速贴壁后, 吸出未贴壁的心肌细胞悬液, 配成约4×105个细胞/ml, 将细胞接种于25 ml的玻璃培养瓶中, 每瓶4 ml。48 h后换为含1%血清的DMEM培养液, 72 h换为FCGM, 同时加入多种干预因素, 培养72 h后收集细胞,用Bradford法［5］测定心肌细胞蛋白质含量, 并根据各瓶细胞数, 计算出每瓶细胞的总蛋白质含量和每个心肌细胞的蛋白质含量。 实验均重复3次。

1.5心肌细胞的［3H］-Leu掺入测定将含有0.1 mmol/L Brdu、细胞浓度为4×105个/ml的心肌细胞接种于24孔培养板上, 每孔1 ml,每4孔为一组。 48 h换为含1%血清DMEM培养液, 72 h换为含有［3H］-Leu 3.7×104 Bq/孔(北京原子能研究所)以及各种干扰因素的FCGM,继续培养72 h, 用D-Hanks液充分冲洗, 以洗去游离的同位素, 将细胞收集于玻璃纤维滤膜上, 然后用10%三氯乙酸和无水乙醇再冲洗。 滤膜烘干后置于含4 ml闪烁液的液闪杯中, 用FJ-2107P液体闪烁仪(国营二六二厂制造)测定放射性强度。 实验均重复3次。

1.6统计学处理所有数据均以±s表示, 组间数据处理根据处理方差齐性分析结果, 采用非配对t检验, P＜0.05被认为有意义。

2结果

2.1FCGM对培养新生大鼠心肌细胞表面积、蛋白质含量及 ［3H］-Leu掺入的影响

用无血清DMEM培养液培养成纤维细胞, 分别在不同的时间间隔中(第3、5、7、9天)收集FCGM, 心肌细胞经FCGM培养72 h后,分别测定细胞表面积、蛋白质含量和［3H］-Leu掺入。 与未经成纤维细胞培养过的无血清DMEM培养液(C)相比, 第3、5天和第7天的FCGM明显增加心肌细胞表面积、蛋白质含量和［3H］-Leu掺入(图1),而心肌细胞的数目无明显变化(4×105个/ml)。

图1.不同时间收集的FCGM对培养新生大鼠心肌细胞表面积、蛋白质含量和［3H］-Leu掺入的影响

fig.1.Effect of collected FCGM at different times on cell surface area, protein content and ［3H］-Leu incorporation in cultured neonatal rat cardiomyocytes. C: control. *P＜0.05, **P＜0.01 compared with control group.

用第3天收集的FCGM与无血清DMEM培养液混合, 配成含不同百分比(100%、80%、60%、40%和20%)的培养液培养心肌细胞72 h,然后测定心肌细胞表面积、蛋白质含量和［3H］-Leu掺入。 与无血清DMEM培养液(C)相比, 含40%以上的FCGM的培养液,能增加心肌细胞表面积、蛋白质含量和［3H］-Leu掺入(图2)。 心肌细胞的数目无明显变化(4×105个/ml)。

图2.不同浓度的FCGM对培养新生大鼠心肌细胞表面积、蛋白质含量和［3H］-Leu掺入的影响

fig.2.Effect of FCGM of different concentrations on cell surface area, protein content and ［3H］-Leu incorporation in cultured neonatal rat cardiomyocytes. C: control. *P＜0.05,**P＜0.01 compared with control group.

2.2BQ123、CV11974和regitin对FCGM促进心肌细胞表面积、蛋白质含量和［3H］-Leu掺入的影响

第3天收集的FCGM与无血清DMEM培养液(C)比较, FCGM能明显增加心肌细胞的表面积、蛋白质含量和［3H］Leu-掺入。 ETA受体拮抗剂BQ123(1×10－6 mol/L)可以阻断FCGM的这种作用, 血管紧张素Ⅱ AT1受体拮抗剂CV11974 (1×10－4mol/L)和α-肾上腺素受体拮抗剂regitin(1×10－6 mol/L)无阻断作用(图3)。 心肌细胞数目为1×106个/ml。

图3.BQ123、CV11974和regitin对FCGM增加心肌细胞表面积、蛋白质含量和［3H］-Leu掺入的影响

fig.3.Effect of BQ123, CV11974 and regitin on FCGM promotion of cell surface area, protein content and ［3H］-Leu incorporation in cultured neonatal rat cardiomyocytes. C: control. F: FCGM.*P＜0.05,**P＜0.01 compared with free-serum dMEM group;#P＜0.05,##P＜0.01 compared with FCGM group.

2.3百日咳毒素(pertussis toxin, PTX)对FCGM促进心肌细胞表面积、细胞蛋白质含量和［3H］Leu-掺入的影响

实验用第3天收集的FCGM, 在无血清DMEM培养液中用PTX (1×10－6 mol/L)预处理1 h, 再换为含有PTX (1×10－6 mol/L)的FCGM培养心肌细胞72 h, PTX能明显抑制FCGM促进心肌细胞表面积、蛋白质含量和［3H］-Leu的掺入(图4)。 心肌细胞数目为1×106个/ml。

图4.百日咳毒素对FCGM促进新生鼠心肌细胞表面积、蛋白质含量和［3H］-Leu掺入的影响

fig.4.Effect of PTX on FCGM promotion of cell surface area, protein content and［3H］-Leu incorporation in cultured neonatal rat cardiomyocytes. C: control. F: fCGM.*P＜0.05,**P＜0.01 compared with free-serum DMEM group,#P＜0.05,##P＜0.01 compared with FCGM group.

2.4蛋白激酶C 对FCGM促进心肌细胞表面积、蛋白质含量和［3H］-Leu掺入的影响

实验用第3天收集的FCGM, 在无血清DMEM培养液中用蛋白激酶C (PKC)抑制剂staurosporine (ST, 1×10－6 mol/L)预处理1 h, 再换为含有ST (1×10－6 mol/L) 的FCGM培养心肌细胞72 h。 ST能明显抑制FCGM促进心肌细胞表面积、蛋白质含量和［3H］-Leu掺入的增加(图5)。 心肌细胞数目为1×106个/ml。

图5.蛋白激酶C对FCGM增加新生鼠心肌细胞表面积、蛋白质含量和［3H］-Leu掺入的影响

fig.5.Effect of protein kinase C on FCGM promotion of cell surface area, protein content and ［3H］-Leu incorporation in cultured neonatal rat cardiomyocytes. C: control. F: FCGM.*P＜0.05,**P＜0.01 compared with free-serum dMEM group;#P＜0.05,##P＜0.01 compared with FCGM group.

3讨论