摘要：本研究通过传代培养小鼠骨髓内皮细胞系细胞, 收集无血清条件培养液(mBMEC-CM), 将其作多级串联超滤, 获得分子量大于10、 3～10、 1～3、 0.5～1 kD和小于0.5 kD超滤组分。 进行粒巨噬系造血祖细胞集落形成试验, 检测了它们的作用。 mBMEC-CM 和3～10 kD组分对粒巨噬系祖细胞(CFU-GM)生长未见明显影响, 而分子量大于10 kD和0.5～1 kD组分促进CFU-GM的增殖, 分子量1～3 kD和小于0.5 kD组分则抑制CFU-GM的增殖。 这4种超滤组分对CFU-GM生长的效应均有剂量依赖性。 这些结果提示, 在体外培养条件下, 小鼠骨髓内皮细胞分泌若干种活性成分, 分别对CFU-GM的生长起促进或抑制作用。骨髓造血微环境中, 包括内皮细胞在内的基质细胞通过产生细胞因子促进或抑制造血干/祖细胞生长演化, 这是骨髓微环境调控造血过程的一种主要方式^［1,2］。 体外培养条件下, 骨髓基质细胞能分泌多种造血调控因子进入培养上清, 检测各类基质细胞条件培养液的造血调控活性, 分析其中的细胞因子, 对深入揭示骨髓微环境的调控造血机制是十分关键的^［3］。 本工作用我们近期建立的小鼠骨髓内皮细胞系, 进行细胞培养, 获取无血清条件培养液, 应用多级串联超滤技术从中分离出不同分子量范围的超滤组分, 检测了它们对粒巨噬系祖细胞(CFU-GM)生长的作用。

1材料和方法

1.1动物、 细胞系和主要试剂Balb/C小鼠, 2～3月龄, 体重22～25 g, 雌雄不拘。 小鼠骨髓内皮细胞系系由我室建立^［4］。 DMEM培养基为Sigma粉剂, 三蒸水溶解, 加双抗, 用NaHCO₃调pH为7.2, 过滤除菌。 新生牛血清(NBS)购于杭州四季青生物工程材料所, 马血清(HS)购于中国军事医学科学院。 重组小鼠粒巨噬系集落刺激因子(rmGM-CSF)为Genzyme产品。

1.2小鼠骨髓内皮细胞系传代培养和无血清条件培养液(mBMEC-CM)制备小鼠骨髓内皮细胞系细胞传代培养于20% NBS的DMEM培养液, 每ml培液含rmGM-CSF 100 ng, 37℃、 5% CO₂、 饱和湿度条件下培养, 每周1～2次半量或全量换液。 当移种于培养瓶的细胞生长至亚融合层时, 吸出上悬液, 用37℃的磷酸盐缓冲液(PBS, pH 7.2)洗培养瓶3次, 以充分洗净细胞层和瓶壁上的残留血清。 然后, 加入纯DMEM培养液, 每cm²瓶底约0.1 ml DMEM液。 在相同条件下培养48 h, 吸出培养上悬液, 离心, 吸取上清, 用0.45μm孔径的混合醋酸纤维膜过滤, －20℃保存备用。

1.3mBMEC-CM的多级串联超滤离心浓缩超滤:取上述制备的mBMEC-CM, 先用分子量截止值为10 kD的离心超滤器(Amicon, Centriprep-10)作超滤, 得到分子量大于10 kD成分浓缩的保留液和分子量小于10 kD的超滤液。 接着将后者用分子量截止值为3 kD的离心超滤器(Amicon, Centriprep-3)作进一步超滤, 得到分子量3～10 kD成分浓缩的保留液和分子量小于3 kD的超滤液。 然后, 分别将以上两种保留液加DMEM液稀释, 再用原超滤器作超滤浓缩, 超滤液弃去, 保留液则如此重复超滤数次, 最后使这两种保留液中分子量大于所用超滤器分子量截止值的成分浓缩5倍,而分子量小于所用超滤器分子量截止值的成分稀释500倍。

氮压浓缩超滤: 用Amicon Model 8微型超滤装置, 配套YM1型(分子量截止值为1 kD)和YC型(分子量截止值为0.5 kD)Diaflo超滤膜,接氮气压力源, 调压强为0.4 MPa, 取上述离心超滤所得分子量小于3 kD的超滤液, 作类同于前述离心超滤法的分级串联超滤。 得到两种保留液和一种超滤液。一种保留液中, 分子量1～3 kD成分浓缩5倍, 分子量小于3 kD成分稀释500倍; 另一种保留液中, 分子量0.5～1 kD成分浓缩5倍, 分子量小于0.5 kD成分稀释500倍; 超滤液所有成分的分子量小于0.5 kD, 浓度与mBMEC-CM原液相同。

通过以上逐级串联的离心超滤和氮压超滤, 最后, 共获得5种mBMEC-CM超滤组分(以下称作大于10、 3～10、 1～3、 0.5～1 kD和小于0.5 kD组分), 均分别除菌过滤, 分装, －20℃保存备用。

1.4骨髓细胞悬液制备和CFU-GM培养颈椎脱臼处死Balb/C小鼠, 无菌条件下取出股骨, 用DMEM液冲出骨髓, 制成单细胞悬液, 计数。 CFU-GM培养采用半固体琼脂法,培养体系为: DMEM液、 25% HS、 0.3 % 琼脂、 rmGM-CSF 75 ng/ml、 骨髓细胞(BMC)浓度1.5×10⁵/ml。实验组分别加入mBMEC-CM及其各种超滤组分(浓度见结果部分)。 各组体系均用直径30 mm的玻璃皿培养, 1 ml/皿, 3皿/组。 置37℃、 5% cO₂、 饱和湿度下培养7 d, 光镜下计数CFU-GM集落数。

1.5统计学分析实验数据表示为 x

±s, Sigma Plot软件作图, t检验判别组间均数差异的显著性。

2结果

2.1mBMEC-CM及其超滤组分对CFU-GM集落生成数的影响

将mBMEC-CM及其分子量大于10、 3～10、 1～3、 0.5～1 kD和小于0.5 kD组分, 分别加入各实验组小鼠骨髓CFU-GM培养体系,其中mBMEC-CM原液和小于0.5 kD组分在体系中的最终浓度为30%(v/v), 其余4种超滤组分在体系中的最终浓度为6%(v/v, 因其浓缩成分的浓度是mBMEC-CM原液的5倍)。结果如图1所见。 与对照组相比, mBMEC-CM原液及3～10 kD组分组的CFU-GM集落数未见明显差异; 大于10 kD和0.5～1 kD组分组的CFU-GM集落数显著增加;1～3 kD和小于0.5kD组分组的CFU-GM集落数显著减少。

图1mBMEC-CM及其超滤组分对CFU-GM生长的作用

Fig.1Effects of mBMEC-CM and its ultrafiltrated components on the growth of CFU-GM

^*P＜0.05, ^**P＜0.01, ^***P＜0.001, compared with control.

2.2大于10 kD和0.5～1 kD组分促进CFU-GM生长的剂量依赖性作用

用mBMEC-CM中分子量大于10 kD和0.5～1 kD组分作量效关系检测, 结果如图2。 随大于10 kD组分在2.5%～7.5%(v/v)浓度范围内增高, CFU-GM集落数增加; 在10% 浓度点, 集落数有所回降, 但仍明显高于对照组。 2.5%～10%(v/v)浓度范围内, CFU-GM集落数随0.5～1 kD组分的浓度增高而递增。

图2mBMEC-CM的大于10kD和0.5～1kD组分对CFU-GM生长的剂量依赖性作用

Fig.2Dose-dependent effect of ＞10kD and 0.5～1kD components of mBMEC-CM on the growth of CFU-GM^*P＜0.05, ^***P＜0.001, compared with control.

2.31～3 kD和小于0.5 kD组分抑制CFU-GM生长的剂量依赖性作用

用mBMEC-CM的分子量1～3 kD和小于0.5 kD组分作量效关系检测, 结果如图3。 在2.5%～10%(v/v)浓度范围内, CFU-GM集落生成数随1～3 kD组分浓度增高而递减。 小于0.5 kD组分在10%～40%(v/v)浓度范围内, 随其浓度增高, CFU-GM集落生成数递减。

图3mBMEC-CM的1～3 kD和小于0.5 kD组分对CFU-GM生长的剂量依赖性作用

Fig.3Dose-dependent effect of 1～3 kD and ＜0.5 kD components of mBMEC-CM on the growth of CFU-GM

Numbers in parentheses are values of concentration of the ＜0.5 kD component.^*P＜0.05, ^***P＜0.001, compared with control.

3讨论

长期骨髓细胞培养(LTBMC)和非骨髓来源血管内皮细胞有关造血调控功能研究的结果, 早已提示骨髓内皮细胞能产出GM-CSF、 粒系集落刺激因子(G-CSF)和白介素(ILs)等造血调控因子^［5,6］。 然而, 真正阐明骨髓内皮细胞的造血调控作用及其机理, 则有赖于对纯骨髓内皮细胞的功能研究。 近来, Raffi等^［7］和Almeida-Porada等^［8］报道, 人的纯骨髓内皮细胞能表达和分泌多种有造血调控作用的细胞因子。

本研究利用我室建立的小鼠骨髓内皮细胞系^［4］, 收集其无血清条件培养液, 并应用串联超滤技术, 从其中制备出分子量大于10、 3～10、 1～3、 0.5～1 kD和小于0.5 kD的组份,检测了它们对CFU-GM生长的作用。 实验结果显示, 这种无血清条件培养液原液对CFU-GM的集落生成未见有明显影响, 但其不同分子量范围的超滤组分, 除3～10 kD组分外, 大于10 kD和0.5～1 kD组分都显著促进 CFU-GM的生长, 而1～3 kD和小于0.5 kD组分对CFU-GM生长均有明显的抑制作用。 这提示骨髓内皮细胞既能分泌正性造血调控因子, 也能分泌负性造血调控因子。 可以推测, mBMEC-CM原液未见有促进或抑制CFU-GM生长的效应, 可能是由于所含正性和负性因子对CFU-GM同时发挥作用并处于相对平衡状态。

在2.5%～7.5%(v/v)浓度范围内, 大于10 kD组分对CFU-GM的促生长效应不断增强, 但在7.5%～10%(v/v)范围, 这种作用有所回降, 其原因尚不清楚。 从已报道的研究结果来看, 人骨髓内皮细胞能生成GM-CSF、 G-CSF、 干细胞因子(SCF)、 IL-6