摘要：采用Ca2+荧光示踪剂Fura 2-AM和双波长荧光分光光度法, 观察小檗碱(berberine, Ber)对酶法分离的豚鼠结肠平滑肌细胞内游离钙([Ca2+]i)的影响并探讨其机制。在含1.5 mmol/L CaCl2的HEPES-Ringer缓冲液中, 豚鼠结肠平滑肌细胞[Ca2+]i为108±9.4 nmol/L (n=7), Ber对静息[Ca2+]i无明显影响, ber呈浓度依赖性抑制, 60 mmol/L KCl引起的[Ca2+]i增高, IC50值为34.09 μmol/L。在含1.5 mmol/L ca2+和无Ca2+的缓冲液中, 30、100 μmol/L Ber均显著抑制10 μmol/L ACh所诱发的[Ca2+]i的增高, 且有浓度依赖性; 同样Ber对环匹阿尼酸(CPA)所致的[Ca2+]i增高也有浓度依赖性抑制作用,有钙和无钙条件下IC50分别为37.97 μmol/L和49.70 μmol/L。结果提示, Ber对结肠平滑肌细胞外Ca2+内流和细胞内钙释放均有抑制作用。小檗碱(黄连素, berberine, Ber)是从毛莨科黄连属(Coptis chinensis franch)根状茎中提取的一种异喹啉生物碱,在中国及印度用作止泻药物已有三千余年的历史。 但其作用机制尚未完全阐明,传统上主要用于感染性腹泻的治疗。近年来,研究发现Ber还有抑制小肠粘膜分泌、 扩张血管、抗血小板凝集、抗脑缺血、抗心律失常等作用。研究证实, Ber可抑制神经细胞、心肌细胞等细胞内游离Ca2+浓度的增高[1~3], 认为Ber可能是钙拮抗剂,但目前尚未见有关Ber对胃肠道平滑肌细胞作用的研究报道。本研究旨在通过Ca2+荧光指示剂Fura 2-AM测定Ber对豚鼠结肠平滑肌细胞内游离钙浓度([Ca2+]i)的影响并探讨其作用机制。

试剂与溶液盐酸小檗碱、盐酸维拉帕米从美国Sigma公司购进, 并用四蒸水配制成贮存液; Fura2-AM和环匹阿尼酸(CPA)用二甲基亚砜溶解(均为Sigma公司产品); 乙酰胆碱(ACh)、胎牛血清(BSA)、I型胶原酶、胰蛋白酶抑制剂、右旋葡萄糖(Sigma); tris-碱、EGTA、HEPES (B、M); TritonX-100(Fluka); 其余试剂均为分析纯, 所有溶液均用10 mol/L Tris-Base调整pH值至7.4。HEPES-Ringer缓冲液组分如下(mmol/L): naCl 126, KCl 6, HEPES 6, detrose 11, MgCl2 1.2, CaCl2 1.5。无钙缓冲液成分如下(mmol/L): naCl 129, KCl 6, HEPES 6, detrose 11, MgCl2 1.2, EGTA 0.2。

豚鼠单个结肠平滑肌细胞的制备根据文献方法稍作改进[4,5]。 正常豚鼠由湖北医科大学实验动物中心提供, 体重250~350 g, 雌雄不拘。猛击枕部处死，在靠近回肠处取3~4 cm长的近端结肠片段, 在显微镜下锐性分离浆膜层、粘膜层, 取靠近浆膜侧肌层, 切成2 mm3的小块,置于含胶原酶I(0.6 mg/ml)、胎牛血清(2 mg/ml)和胰蛋白酶抑制剂(0.6 mg/ml)的低钙缓冲液中(Ca2+ 30 μmol/L),通入纯氧, 37℃消化20 min×3次, 吹打振荡后分离出单个平滑肌细胞, 细胞悬液置于细胞培养箱中备用。在倒置显微镜下调整肌细胞数目至每毫升106个,取1滴细胞悬液作台盼蓝排斥试验, 证明细胞成活率在90%以上。在测定ACh和CPA引起的细胞内钙释放实验时, 细胞用无钙缓冲液悬浮, 其余实验均用HEPES-Ringer缓冲液悬浮。

[Ca2+]i测定往细胞悬液中加入终浓度为5 μmol/L的Fura 2-AM, 置于37℃ 5%CO2细胞培养箱中孵育45 min, 常温离心(1?500 r/min)冲洗2次后, 用HEPES-Ringer液或无钙缓冲液悬浮。用RF-5000型荧光分光光度计(Shimadzu, Japan)进行荧光测定。测定条件: 激发狭缝和发射狭缝均为10 nm, 以340和380 nm双波长激发, 激发波长变换时间为2 s, 发射波长500 nm, 响应因子0.02。[Ca2+]i=Kd·(Fo/Fs)·(R－Rmin)/(Rmax－R), 其中, Kd为Fura-2与Ca2+反应的解离常数224 nmol/L。Fs和Fo分别代表Ca2+饱和与为零状态下380 nm波长的荧光强度值, Rmax是Ca2+饱和状态即细胞悬液中加入终浓度0.1% TritonX-100后测定, Rmin为细胞悬液中加入终浓度5 mmol/L eGTA络合Ca2+状态下测得。细胞自身荧光在未负载Fura 2-AM时测得, 计算[Ca2+]i前要先减去细胞自身荧光。

统计分析所有数据均以x±s表示, 统计学处理采用t检验, 半数抑制浓度IC50由Schild作图法和直线回归计算[6]。

结果如下:

1.Ber对静息状态[Ca2+]i和KCl所致豚鼠结肠平滑肌[Ca2+]i增高的影响

细胞外Ca2+浓度([Ca2+]o)为1.5 mmol/L时, 豚鼠结肠平滑肌细胞静息[Ca2+]i为108±9.4 nmol/L。加入Ber(1、3、10、30、100μmol/L)以及Ver 5 μmol/L后, 静息[Ca2+]i见表1。经统计学检验, P＞0.05, 表明不同浓度的Ber对结肠平滑细胞静息[Ca2+]i无明显影响。60 mmol/L KCl使结肠平滑肌细胞[Ca2+]i增高至486±19.5 nmol/L。Ber浓度依赖性抑制60 mmol/L KCl引起的[Ca2+]i增高,浓度为1、3、10、30和100 μmol/L时, 抑制率分别为2.4%、7.9%、23.3%、56.1%和73.0%, IC50为34.09 μmol/L[95% 可信限(CI)为(28.25~41.13) μmol/L]; 5 μmol/L Ver的抑制率为53.2%。

2.Ber对ACh诱导的豚鼠的结肠平滑肌细胞[Ca2+]i增高的影响

[Ca2+]o为1.5 mmol/L时, ACh 10 μmol/L使豚鼠结肠平滑肌细胞[Ca2+]i升高至213±20.7 nmol/L, 增幅为97.2%。预先给予30、100 μmol/L Ber和5 μmol/L Ver后, 均显著抑制ACh诱导的[Ca2+]i升高,抑制率分别为24.2%、59.1%和56.1%。而当细胞外液采用无钙缓冲液即[Ca2+]o为0时, 豚鼠结肠平滑肌细胞在静息状态下[Ca2+]i为72±11.8 nmol/L。 加入10 μmol/L ACh 后, [Ca2+]i 升高至138±16.3 nmol/L, 30、100 μmol/L Ber和5 μmol/L ver对[Ca2+]i的升高仍有显著的抑制作用, 抑制率分别为31.4%、79.0%和81.9%。

3.Ber对CPA引起的豚鼠结肠平滑肌细胞[Ca2+]i增高的影响

往细胞悬液中加入终浓度30 μmol/L CPA, 在[Ca2+]o为0时, 可使豚鼠结肠平滑肌细胞[Ca2+]i从静息水平72±11.8 nmol/L升高至252±42.0 nmol/L; 而在[Ca2+]o为1.5 mmol/L时, 使[Ca2+]i从108±9.4 nmol/L升高至446±38.7 nmol/L。3、10和30μmol/L的Ber对CPA引起的[Ca2+]i增高的抑制率在有钙和无钙条件下分别为20.1%、33.1%、46.8%、13.9%、26.7%和41.7%。有钙条件下Ber的IC50为37.79μmol/L [95% CI为(23.61~60.40) μmol/L], 无钙时IC50为49.70 μmol/L [95% cI为(23.44~105.68) μmol/L]。

细胞外高K+状态可引起平滑肌细胞膜去极化并开放电压依赖钙性Ca2+通道(potential-dependent calcium chanel, PDC)[7],主要是L型钙通道, 促进胞外Ca2+内流, 造成[Ca2+]i升高, 这时很少或没有内质网Ca2+的参与; Ber对KCl引起的豚鼠结肠平滑肌细胞[Ca2+]i的增高呈浓度依赖性抑制,表明Ber对电压依赖性Ca2+通道具有拮抗作用, 通过半数抑制浓度IC50比较, 其强度比Ver弱。有文献报道, G蛋白是许多受体与Ca2+通道的媒介,许多介质如5-HT、ACh等与相应受体结合后, 通过G蛋白耦联开放Ca2+通道。 G蛋白不仅通过第二信使如cGMP调控Ca2+通道,而且对Ca2+通道还有直接作用。在细胞外钙存在时, 较高浓度的ACh不仅可激活平滑肌细胞PDC,还可通过受体激活受体操纵性钙通道(receptor-operated calcium channel, ROC), 从而促使细胞外钙内流,同时也激活细胞内贮存钙池释放Ca2+[8], 共同作用升高[Ca2+]i。 但在胞外钙为零时, 通过ACh只能促进胞内贮存钙释放Ca2+。环匹阿尼酸CPA是细胞内质网(endoplasmic reticulum, ER)/肌浆网(sarcoplasmic reticulum, SR)膜上Ca2+泵的特异性抑制剂,它能特异地与Ca2+泵发生不可逆的结合, 抑制Ca2+泵回摄胞浆Ca2+进入ER/SR, 从而影响IP3敏感性和Ryanodine敏感性钙池,造成ER/SR泵漏平衡失调, 进而耗竭细胞内贮存钙池, 导致[Ca2+]i升高, 同时, 它又激活Ca2+释放激活的Ca2+内流(ICRAC), 通过充电式Ca2+内流机制触发细胞外Ca2+内流(受体操纵性Ca2+内流)[9,10]。

在含1.5 mmol/L Ca2+的细胞悬液中, Ber浓度依赖性地拮抗ACh引起的豚鼠结肠平滑肌细胞[Ca2+]i升高, 这表明Ber一方面抑制电压依赖性Ca2+内流,另一方面对ACh受体通过G蛋白耦联激活的Ca2+内流也具有抑制作用。同样在含Ca2+细胞悬液中, Ber对CPA引起的结肠平滑肌细胞[Ca2+]i升高有抑制作用,也证实Ber可抑制ICRAC。通过本研究可以看出, 在细胞外Ca2+浓度[Ca2+]o为零的情况下, Ber同样可以抑制ACh诱导的豚鼠结肠平滑肌细胞[Ca2+]i的升高,而此时没有细胞外Ca2+内流的参与, 表明Ber对结肠平滑肌细胞内贮钙释放通道也具有抑制作用, 推测可能是Ber主要影响平滑肌细胞Ryanodine受体系统调节的IP3不敏感性钙池释放的结果。同样在细胞外液无钙条件下, ber对CPA导致的豚鼠结肠平滑肌细胞[Ca2+]i升高的抑制作用, 表明Ber可拮抗CPA引起的细胞内贮存Ca2+释放,这可能与它阻断CPA对钙泵的抑制作用有关, 或者Ber可以促进钙泵的复活, 增强Ca2+-ATP酶的活性, 促进Ca2+/H+、Ca2+/Na+交换,使胞浆中的Ca2+进入ER/SR的贮存钙池。

本研究表明, Ber对结肠平滑肌细胞外Ca2+内流和细胞内钙释放导致的[Ca2+]i升高均有抑制作用, 提示Ber可能是一种钙通道拮抗剂, 故Ber可抑制肠道的运动。但Ber对肠道平滑肌各型钙通道和钾通道活性的影响还有待于使用膜片箝技术进一步研究。

参考文献

[1]Huang WM (黄伟民), Xu SZ (徐尚忠). Effects of berberine on membrane potential and contraction activity of smooth muscle in guinea pig portal vein. Chin J Circ(中国循环杂志), 1995; 10: 100~102 (in Chinese with English abstract).

[２]Chu ZL (储仲禄), Huang MG (黄木国), Lai FS (赖福生). The anti-platelet-rich-plasma-clot-retraction effect of berberine and its mechanism. chin Pharmacol Bull (中国药理学通报), 1994, 10: 114~116 (in Chinese with English abstract).