摘要：>应用大鼠游离胃窦平滑肌细胞, 观察胃动素和胃泌素对胃窦平滑肌细胞收缩作用的胞内信号转导通路。结果显示: (1)胃动素和胃泌素对胃窦平滑肌细胞均有收缩作用;(2) Gαi-3抗体可抑制胃动素和胃泌素加强胃窦平滑肌细胞的收缩, 胃动素、 胃泌素明显增加Gαi-3抗体与[35S]GTPγS的结合;(3)磷脂酶C抑制剂U-73122、 三磷酸肌醇受体拮抗剂肝素可抑制胃动素和胃泌素引起的胃窦平滑肌细胞的收缩。结果表明: 胃动素和胃泌素通过兴奋与磷脂酶C耦联的Gi蛋白,产生三磷酸肌醇, 激发胃窦平滑肌细胞的收缩反应。胃动素与胃泌素属于兴奋胃肠运动的脑肠肽, 胃动素是启动消化间期胃肠移行性复合运动(MMC)的重要激素[1],胃泌素可促进空腹和餐后胃的运动[2]。我们的研究证明[3~5], 胃动素和胃泌素对胃平滑肌细胞有直接兴奋作用, 可使胞内Ca2+释放。但胃动素、胃泌素引起胃平滑肌细胞收缩的胞内信号转导通路尚不清楚, 本研究旨在探讨胃动素和胃泌素引起大鼠胃窦平滑肌细胞收缩中, G 蛋白和磷脂酶C的作用。

１材料和方法

1．1实验动物 成年健康Wistar大鼠, 180~250 g, 雌雄兼有, 由中国医学科学院实验动物中心提供。实验前大鼠禁食18~24 h, 饮水不限。

1．2试剂 胶原酶Ⅱ型, 大豆胰蛋白酶抑制剂, 胃动素, 胃泌素-17 (G-17), 磷脂酶C抑制剂U-73122, 三磷酸肌醇受体拮抗剂肝素,鸟苷5′-O-(3-硫)三磷酸(GTPγS), 皂苷均为Sigma公司产品。兔多克隆G蛋白抗体Gαs、 Gαi-3、 Gαq/11为Santa cruz公司产品, Gαi-3抗体与Gαi1、 Gαi2和Gαi3均有交叉反应。羊抗兔抗体(亲和纯化)为华美公司产品。[35S]GTPγS (4.2×1013 bq/mmol)为Amersham公司产品。

1．3游离的单个胃平滑肌细胞的制备[3] 大鼠用戊巴比妥钠(30 mg/kg)进行腹腔麻醉, 迅速取出胃并置于4℃氧饱和的生理盐水中, 沿胃小弯剪开,立即转移到HEPES缓冲液(mmol/L: HEPES 24.5, NaCl 101, KCl 13, NaH2PO4 2.5, CaCl2 1.8, mgCl2 1.2, 葡萄糖 11.5, 2% MEM, pH 7.4)中, 去除粘膜与浆膜, 将胃窦(距幽门0.3~0.5 cm)平滑肌剪碎成2 mm×2 mm的小肌块, 加入含0.1%胶原酶和0.01%胰蛋白酶抑制剂的HEPES缓冲液中, 通入95% O2、 5% CO2, 31℃孵育30 min。消化完毕,用无酶的HEPES缓冲液冲洗, 继续在此缓冲液中孵育30 min, 用500 μm的分子筛过滤, 收集游离的单个胃窦平滑肌细胞。

1．4可通透胃平滑肌细胞的制备[6] 由于G蛋白抗体和肝素不能透过完整的细胞膜, 所以需制备可通透细胞, 观察两者对胃窦平滑肌细胞的作用。具体方法为,当酶消化过程完成后, 将消化液吸出, 并用细胞质缓冲液(mmol/L: NaCl 20, KCl 100, MgSO4 5, NaH2PO4 0.96, caCl2 0.61, EGTA 1, 2% BSA, pH 7.2)洗3次, 将洗液与消化液一起, 1?000 r/min离心5 min, 弃上清, 用2 ml的细胞质缓冲液悬浮沉淀, 并吹打成细胞悬液。细胞分散后, 加入75 μg/ml的皂苷孵育4 min, 离心1?000 r/min, 5 min,沉淀重新悬浮于无皂苷的、 含1.5 mmol/L ATP, 5 mmol/L磷酸肌酸, 10 U/ml 肌酸磷酸激酶的细胞质缓冲液中。

1．5胃平滑肌细胞膜的制备[6] 将胃窦平滑肌块置于冰冷的缓冲液(mmol/L: HEPES 20, MgCl2 2, EDTA 1, DTT 2, pH7.4)中, 冰浴超声粉碎, 粉碎液离心600 g, 2 min, 收集上清, 沉淀后再次超声粉碎, 并用两层200 μm的尼龙网过滤, 合并2次上清, 4℃40?000g离心30 min。膜沉淀混溶于缓冲液(mmol/L: HEPES 20, NaCl 240, EDTA 2, leupeptin 2, phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) 2, pH 7.4)中, 考马斯亮蓝G-250染色法测定样品的蛋白含量。

1．6细胞收缩反应的测量 在胃窦平滑肌细胞悬液中, 分别加入胃动素(4×10-10、 4×10-9、 4×10-8、 4×10-7、 4×10-6 mol/L)、 G-17 (10-12、 10-11、 10-10、 10-9、 10-8 mol/L)反应30 s, 以2.5%戊二醛终止反应。观察肝素(10μg/ml)、 U-73122 (10-2 mol/L)对胃动素、 G-17作用的影响时, 先在细胞悬液中加入肝素、 U-73122作用60 s,随后再加入胃动素(4×10-7 mol/L)或G-17 (10-9 mol/L)。观察G蛋白抗体对胃动素(4×10-7 mol/L)、 G-17 (10-9 mol/L)作用的影响时, 先在可通透细胞悬液中加入1∶200的抗体孵育1h。在倒置显微镜下, 用测微尺测定随机遇到的30个完整细胞的长度,计算其平均值。以细胞长度缩短的百分数表示细胞收缩的变化,即细胞收缩百分率=(给药组细胞平均长度－对照组细胞平均长度)/对照组细胞平均长度×100%。在胃窦平滑肌细胞悬液中, 细胞记数约为106细胞/ml。

1．7[35S]GTPγS结合实验[8] 将胃窦平滑肌细胞膜蛋白加入含1 μmol/L GDP的G蛋白测定缓冲液(mmol/L: HEPES 10, EDTA0.1, MgCl2 10, pH 7.4), 置于25℃水浴摇床30 min, 随后加入0.5 nmol/L [35S]GTPγS, 继续反应30 min,终体积500 μl。用冰冷的缓冲液(Tris-HCl 100, MgCl2 10, NaCl 100, pH 8.0)终止反应, GF/B滤膜快速抽滤,滤膜用终止缓冲液洗3遍, 干燥后液闪测定cpm。对照管不含胃动素或G-17, 非特异结合管中加入100 μmol/L的非标记的GTPγS。同一反应体系做3个复管。

1．8ELISA法测定[35S]GTPγS结合实验[6] 将胃窦平滑肌细胞膜蛋白加入G蛋白测定缓冲液中, 加入30 nmol/L的[35S]GTPγS,37℃孵育, 总体积300 μl, 用10倍体积、 含20 μmol/LGTP的冰冷终止液终止反应, 将200 μl的反应液加至已包被好特异性G蛋白抗体的酶标板内,冰上孵育2 h后, 用含0.05% Tween 20的冰冷PBS洗3次, 每次5 min, 于孔干燥后液闪测定cpm。酶标板先用1∶1?000的羊抗兔IgG抗体包被,再用1∶1?000的特异性G蛋白抗体包被。对照管不含胃动素或G-17。同一反应体系做3个复管。

1．9统计学处理 各组实验数据以平均数±标准误(x±sx), 组间差异的比较采用双侧t检验。

2结果

２.１胃动素和胃泌素对胃平滑肌细胞收缩活动的作用

胃动素在剂量为4×10-10~4×10-6 mol/L范围内, 胃泌素在剂量为10-12~10-8 mol/L范围内,均对大鼠胃窦平滑肌细胞有明显增强收缩的作用, 呈剂量-效应关系。阈反应浓度胃动素和胃泌素分别为4×10-9和10-11 mol/L,最大反应浓度分别为4×10-7和10-9 mol/L。胃动素引起细胞出现的最大收缩反应为(26.7±4.1)%,胃泌素则为(29.8±3.8)%。以下实验均采用最大反应浓度剂量。

2.2磷脂酶C抑制剂U-73122对胃动素、 胃泌素-17增强胃窦肌细胞收缩效应的影响

磷脂酶C抑制剂U-73122 (10-2 mol/L)可以明显抑制胃动素和胃泌素对胃窦平滑肌细胞的收缩作用。细胞缩短百分数由单独胃动素的(25.9±2.1)%降至加入U-73122的(4.7±1.2)%,抑制胃动素效应的75%(P＜0.01)。单独胃泌素引起胃窦肌细胞缩短(24.4±1.7)%, 而胃泌素加入U-73122肌细胞则缩短为(6.4±0.7)%,抑制胃泌素效应的81%(P＜0.01)。

fig. 2.Effects

2.3三磷酸肌醇受体拮抗剂肝素对胃动素、 胃泌素-17增强胃窦肌细胞收缩效应的影响

胃动素加三磷酸肌醇受体拮抗剂肝素10 μg/ml后,使胃窦平滑肌细胞缩短百分数由单独胃动素的(25.9±2.1)%降为(8.1±0.6)%。胃泌素加肝素则由(24.4±1.7)%降为(6.4±1.5)%。肝素分别抑制胃动素效应的70%(P＜0.01)和胃泌素效应的80%(P＜0.01)(图2)。

2.4特异性G蛋白抗体对胃动素和胃泌素-17增强胃窦肌细胞收缩效应的影响

gαi-3抗体、 Gαs抗体和Gαq/11抗体可分别抗Gi、 Gs和Gq/11蛋白α亚单位羧基端的氨基酸序列,阻断G蛋白与受体的相互作用。Gαi-3抗体可抑制胃动素、胃泌素对胃窦平滑肌细胞的收缩作用,分别抑制胃动素效应的64%(P＜0.05)和胃泌素效应的71%(P＜0.05), 而Gαs抗体、 Gαq/11抗体对胃动素和胃泌素的作用则无明显影响(图3)。这表明与胃动素和胃泌素受体耦联的胃窦平滑肌细胞膜的G蛋白为Gi蛋白。

2.5胃动素和胃泌素对胃平滑肌细胞膜[35S]GTPγS结合的影响

胃动素、 胃泌素刺激胃窦平滑肌细胞膜后, [35S]GTPγS结合率明显升高, 与对照组(无胃动素、 胃泌素)比较,[35S]GTPγS结合分别增加55%(P＜0.05)和56%(P＜0.05)。说明胃动素和胃泌素受体

图3.G蛋白亚单位抗体对胃动素和胃泌素引起大鼠胃窦平滑肌细胞收缩效应的影响

fig. 3.Effects of antibodies to G protein subunits on contraction of antral smooth muscle cells in response to motilin and gastrin. Data are presented as mean±SE, (n=5). *P＜0.05 vs control (motilin or gastrin alone).

与G蛋白耦联。胃动素和胃泌素还明显引起Gαi-3抗体与[35S]GTPγS结合的增加, 分别升高16%(P＜0.05)和26%(P＜0.05)(图4), 而Gαs、 gαq/11抗体与[35S]GTPγS的结合无明显变化。进一步证明胃动素和胃泌素激活胃窦平滑肌细胞膜的Gi-蛋白。

图4.胃动素和胃泌素对胃窦平滑肌细胞膜[35S]GTPγS结合的影响

fig. 4.[35S]GTPγS binding to motilin and gastrin activated membranes of antrum. a. Motilin and gastrin caused an increase of [35S]GTPγS binding. Data are presented as mean±SE, (n=5). B. Motilin and gastrin induced an increase of[35S]GTPγS binding of Gαi-3, but not of Gαs and Gαq/11. Data were expressed as percent increase of binding from basal level (without motilin or gastri