摘要：在体外培养的血管平滑肌细胞上, 采用蛋白印迹杂交免疫沉淀的方法, 研究尾加压素Ⅱ(UⅡ)与粘着斑激酶(FAK)介导的信号传导之间的关系。结果表明, UⅡ在10^－8、 10^－7和10^－6 mol/L的浓度时, 可分别使FAK活力增加2.2、 3.04和0.73倍; 加入UⅡ(10^－7 mol/L) 5 min后, FAK活力增加95%, 但与对照组相比无显著性差异(P＞0.05), 刺激10 min后, FAK活力升高3.7倍, 和对照组相比有显著性差异(P＜0.05)。至30 min时活力显著升高, 较对照组增加4.8倍(P＜0.01)。UⅡ刺激平滑肌细胞30 min内, FAK的蛋白含量无明显变化; 在UⅡ作用2 h后, FAK的含量增加36%, 至4 h达高峰, 与对照组相比增加53%, 6 h后降低; 细胞松弛素B不能抑制UⅡ对FAK的激活; 丝裂素活化蛋白激酶的抑制剂PD98059 (50 μmol/L), 钙调素依赖性蛋白激酶的抑制剂W7 (50 μmol/L), 对FAK的激活无影响(P＞0.05); 蛋白激酶C的阻断剂H7 (50 μmol/L), 可与UⅡ发生协同作用, 使FAK活力较单纯UⅡ组增加1.98倍。因此, UⅡ与FAK介导的信号转导途径之间存在着密切的关系, 且这种关系不依赖于细胞骨架的完整性, 与蛋白激酶C介导的信号转导途径有密切的关系。

尾加压素Ⅱ(urotensinⅡ, UⅡ)是迄今被发现的人体内最强的缩血管活性肽, 能刺激血管平滑肌细胞增殖, 在动脉粥样硬化、高血压和血管成形术后再狭窄等疾病的发生中起重要作用^［1,2］。粘着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)是一种非受体型的酪氨酸激酶, 主要参与整合素介导的信号传导, 对细胞的迁移和增殖具有重要影响^［3～5］。UⅡ与FAK介导的信号转导途径之间的关系, 目前尚不清楚。本实验拟在体外培养的大鼠主动脉血管平滑肌细胞上, 采用蛋白印迹杂交和免疫沉淀的方法, 研究UⅡ对FAK含量与活力作用, 以探讨UⅡ对血管平滑肌细胞内信号转导的影响。

1材料和方法

1.1实验动物兔源性FAK多克隆抗体与小鼠源性PY20单克隆抗体购自Santa Cruz公司, UⅡ由美国Phoenix公司惠赠, Wistar大鼠购自北京医科大学实验动物中心。

1.2大鼠主动脉血管平滑肌细胞培养参照文献［6］加以改进, 将体重150～200g的Wistar大鼠经乙醚麻醉后, 在严格无菌条件下, 迅速取出胸主动脉, 放入Hanks液中冲洗。然后用弯头镊刮除血管内外膜, 转入盛有1 ml RPMI 1640培养液的青霉素小瓶中剪碎(约1 mm²), 加入细胞培养瓶中。再将细胞瓶反置于CO₂培养箱中贴壁4 h后, 加入4 ml含20%胎牛血清的1640培养液。细胞长满后, 传代培养。本实验选用10代以内的细胞, 采用倒置相差显微镜和α肌动蛋白染色, 对平滑肌细胞进行鉴定。发现细胞呈梭形排列, 且α肌动蛋白染色呈阳性。

1.3蛋白印迹杂交^［7］加入不同浓度的UⅡ, 在不同时间弃除培养液, 细胞用生理盐水冲洗3遍。然后加0.3 ml改良的RIPA裂解缓冲液(Tris.HCl, 50 mmol/L, pH 7.5; NaCl, 150 mmol/L; NP-40,1%; 脱氧胆酸钠, 0.5%; SDS, 0.1%; EDTA, 1 mmol/L; PMSF, 1 mmol/L; Leupeptin, 2 μg/ml), 用细胞刮子收集细胞。4℃静置15 min, 10?000 g离心10 min, 弃除沉淀, 用考马斯亮蓝方法对上清进行蛋白定量。取10 μg蛋白, 加入上样缓冲液, 煮沸3 min后进行SDS-PAGE, 转膜, 用1∶1000的抗FAK多克隆抗体进行杂交, 二抗为辣根过氧化酶标记的羊抗兔多克隆抗体, 用1∶10?000稀释, 利用化学发光试剂盒法进行显色反应, 最后对杂交条带进行光密度扫描。

1.4免疫沉淀^［7］组织匀浆后取100 μg总蛋白, 加入10 μl PY99抗体, 4℃反应1 h后加入50 μl蛋白A琼脂糖珠进行沉淀, 用裂解缓冲液洗涤3次。加入上样缓冲液, 煮沸3 min, 进行SDS-PAGE, 转膜, 用1∶1?000的抗FAK抗体进行杂交, 二抗采用1∶10?000稀释, 利用化学发光法进行显色反应。

1.5统计学处理结果以均数±标准差表示, 采用单因素方差分析和均数间两两比较方法, 以P＜0.05为差异有显著性。

2结果

2.1时效关系

FAK是一种酪氨酸磷酸激酶, 可通过自身磷酸化激活, 通常以它的磷酸化水平反映其活力。FAK活力的检测在国际上多采用免疫沉淀的方法。先利用酪氨酸激酶的磷酸化抗体, 如PY99, 对蛋白进行沉淀, 再以FAK抗体进行蛋白印迹杂交。加入UⅡ(10^－7 mol/L) 5 min后, FAK活力增加95%, 但与对照组相比无显著性差异(P＞0.05); 刺激10 min后, FAK活力升高3.7倍, 和对照组相比有显著性差异(P＜0.05)。至30 min活力显著升高, 较对照组增加4.8倍(P＜0.01)。UⅡ刺激平滑肌细胞30 min内, FAK的蛋白含量无明显变化(图1); 在UⅡ作用2 h后, FAK的含量增加36%; 至4 h达高峰, 与对照组相比增加53%; 6 h后降低, 与对照组相比降低54%(图2)。

图1.UⅡ短时间刺激FAK含量和活力的影响

Fig. 1.Effect of UⅡ stimulation on FAK expression and ac～tivity in vascular smooth muscle cell.

图2.UⅡ长时间刺激对FAK含量的影响

Fig. 2.UⅡ stimulation of a long time induces the expression of FAK (n=1).

2.2量效关系

加入不同浓度UⅡ刺激细胞30 min后, 发现10^－8、10^－7和10^－6 mol/L的浓度均可刺激FAK活力增加, 较对照组分别增加2.2、3.04和0.73倍, 但对FAK蛋白含量无明显影响(图3)。

图3.不同浓度UⅡ对平滑肌细胞FAK含量(n=1)和活力(n=3)的影响

Fig. 3.Dosage dependence of UⅡ-stimulation FAK expression and activity in vascular smooth muscle cells.

图4.细胞骨架蛋白完整性对FAK磷酸化的影响

Fig. 4.Effect of cytochalasin B on UⅡ-stimulation tyrosine pho～sphorylation of FAK.

2.3细胞骨架蛋白完整性对FAK活力的影响

在加入UⅡ(10^－7 mol/L), 作用细胞30 min后, 发现UⅡ使FAK的活力升高147%; 同时加入UⅡ(10^－7 mol/L)和细胞松弛素(12.5 μmol/L), 可使FAK的活力升高144%, 两组间差异无显著性(P＞0.05)(图4)。

2.4与其它信号转导通路的关系

在加入UⅡ的同时, 分别加入丝裂素活化蛋白激酶的抑制剂PD98059 (50 μmol/L), 钙调素依赖性蛋白激酶的抑制剂W7 (50 μmol/L)和蛋白激酶C的抑制剂H7 (50 μmol/L), 作用细胞30 min后, 发现PD98059和W7组与单纯加入UⅡ组之间的FAK的活力无显著性差异(P＞0.05)。H7组与UⅡ组相比, FAK活力增高1.98倍(图5)。

图5.不同信号转导通路对FAK活化的影响

Fig. 5.Effect of different signal transduction pathway on the activition of FAK induced by UⅡ(n=3).

3讨论

UⅡ是一种环型结构的调节肽, 最初从鱼的脊髓尾部下垂体中分离出来。新近的研究发现, 在人体内也存在UⅡ, 除神经组织外, 血管, 尤其是粥样硬化的脂质沉着区富含UⅡ。UⅡ受体是一种孤儿性G蛋白耦联受体GPR14, 亦主要分布在心血管组织中, 推测其在心血管疾病的发生中起重要作用^［1］。FAK是细胞内多条信号转导通路的交汇点, 在高血压、血管成形术后再狭窄的发生中起重要作用^［8］。当FAK活化以后, 第397位的酪氨酸发生自身磷酸化, 成为与Src家族激酶具有高亲和力的结合位点。Src与FAK结合, 形成FAK/Src复合体, 促使第925位酪氨酸磷酸化, 产生与接头蛋白(adaptor)Grb2的结合位点, 通过Grb2的SH3功能域与鸟嘌呤核苷酸交换因子Sos结合, Sos将Ras蛋白从无活性的Ras-ADP转变为有活性的Ras-ATP。另外, Grb2还可通过与Shc的结合, 激活Ras, 然后活化丝裂原活化蛋白激酶, 作用于转录因子c-fos和c-jun, 最终影响基因的表达, 促进细胞的增殖、迁移^［9］。本实验发现, UⅡ在10^－8至10^－6 mol/L的浓度范围内, 均可激活FAK。UⅡ作用于细胞5 min后, FAK活力增加, 至30 min时达高峰。 但30 min内FAK的蛋白含量无明显变化, 直至作用后2 h, FAK蛋白含量增加, 4 h达高峰, 6 h时FAK蛋白含量减少。因此, 这种早期FAK活力的增加与蛋白的含量无关, 主要是通过自身酪氨酸磷酸化的增加实现的, 而晚期活力的增加与蛋白含量的增加有关。UⅡ与FAK介导的信号转导通路之间存在着密切的关系, 可能是通过对FAK的激活, 促进细胞的增殖。

FAK在整合素介导的信号转导通路中起重要作用。 当整合素聚集后, FAK活力增高, 整合素激活的FAK活化, 需要依赖完整细胞骨架蛋白的存在, 加入细胞松弛素D, 细胞骨