摘要：为研究主动脉前庭自发慢反应电位的去极离子流性质, 利用豚鼠的离体心脏, 常规玻璃微电极细胞内记录方法和离子通道阻断剂, 观测最大舒张电位(MDP)、0相除极幅度(APA)、 0相最大除极速度(Vmax)、 4相自动除极速度(VDD)、 复极50%(APD50)和90% (APD90)的时间以及自发放电频率(RPF)。结果发现:(1) 0.5 μmol/L 尼索地平(Nis)可使该慢电位的APA、 Vmax、 VDD明显减小,RPF减慢, 与给药前相比 P＜0.01; (2) 1.2 mmol/L 河豚毒(TTX)使APA和Vmax 与给药前相比有所减慢(P＜0.05), VDD 和RPF明显减慢(P＜0.01); (3) 2 mmol/L4-氨基吡啶(4-AP)使该慢电位的MDP的绝对值、 APA、 Vmax减小, VDD和RPF加快, 与给药前相比有显著差异(P＜0.01); (4) 1.5 mmol/L CsCl作用5 min时, VDD和RPF明显降低(P＜0.05), 10 min时恢复; (5)无糖低氧液灌流15 min 后, 该慢电位VDD和RPF明显减慢(P＜0.01)。结果表明:(1)该区域自发慢电位0相的主要去极离子流除Ca2+内流外, 还可能有少量Na+内流。(2) 4相去极离子流中, 除Ca2+、 Na+的内流和IK衰减外, if电流可能也起部分作用。心室流出道过去一直被认为是血液的输出径路, 因此, 对其生理特性一直未予以重视。随着医学检测手段的发展,临床上人们已越来越多地了解到心室流出道的功能和意义。目前发现,一些过去一直无法解释和诊断的特发性室颤、早搏、心动过速等心律失常是由右心室流出道形态异常和功能障碍所致[1~3], 因此,对心室流出道的研究已引起众多学者的兴趣。 以往对左心室流出道(主动脉前庭)的研究较少, 尤其是对左心室流出道的电生理特性的研究尚未见报道。我室在过去的工作中发现, 豚鼠主动脉前庭部位存在自律细胞, 其电位特征与窦房结优势起搏细胞和潜在起搏细胞电位相似[4]; 最近,我们又在大鼠和家兔主动脉前庭部记录到相似的慢反应电位[5,6]。这表明主动脉前庭存在自律性是哺乳类心脏的普遍现象。为了进一步阐明该部位自律细胞慢反应电位0相和4相去极化的离子基础,本实验应用常规的玻璃微电极细胞内记录技术, 用离子通道阻断剂, 初步分析了主动脉前庭部位慢反应自律细胞0相和4相的去极离子流。

１材料和方法

1.1 标本制备 选体重250±35g的健康豚鼠, 雌雄不拘。 击脑致昏后迅速开胸取出心脏, 置于O2饱和的Locke液中。 标本制备参见文献[4]。制好的标本用不锈钢针固定于灌流槽内的硅橡胶上, 用改良的Locke液以10 ml/min进行恒速灌流, 温度维持在35±1℃, 灌流液中充以纯O2, pH7.4。 标本在灌流液中稳定30 min后开始实验。

1.2 电位引导 玻璃微电极直流电阻为10~20MΩ。 如能直接记录到自发电位, 则不再进行刺激, 若记录不到,则将刺激电极置于标本远离瓣膜一端的心肌组织上, 给予波宽2 ms、1Hz、二倍于阈强度的方波刺激, 刺激时间由数秒至数分钟不等, 直至诱发出稳定的自发节律,再停止电刺激。 自发节律稳定后开始实验。动作电位经DWF-3型微电极放大器放大后, 一路输入SBR-1型示波器进行观察, 一路输入监听器监听,另一路经高速模数转换器输入微机, 自动显示电信号, 并分析动作电位的各项参数指标。

1.3 观测指标 最大舒张电位(maximal diastolic potential, MDP)、动作电位幅值(amplitude of action potential, APA)、0相最大除极速度(maximal rate of depolarization, Vmax)、4相自动除极速度(velocity of diastolic depolarization of phase 4, VDD)、复极至50%和90%时间(duration of 50% and90% repolarization, APD50 and APD90)和自发放电频率(rate of pacemaker firing, RPF)。

1.4 实验过程和分组 待自发节律稳定10 min后开始采集一组正常的慢反应动作电位作对照, 然后改用其它灌流液灌流, 记录每次灌流后的动作电位变化。实验分为:(1) 0.5 μmol/L 尼索地平(Nis)组(n=6); (2) 1.2 mmol/L 河豚毒(TTX)组(n=6); (3) 2 mmol/L4-氨基吡啶(4-AP)组(n=8); (4) 1.5 mmol/L 的CsCl组(n=8); (5) 低氧无糖组(n=6); (6) 用Glibenclamide(Gli)预处理10 min后再用无糖液(含Gli)灌流组(n=6)。

1.5 统计学处理 应用Excel统计工具进行, 动作电位的各观测指标均以 x±sx表示, 给因素前后各项指标用t检验, 以P＜0.05为有显著差异。

2结果

２.１ Nis对主动脉前庭部慢反应电活动的影响

用0.5 μmol/L Nis灌流后1 min, VDD和 RPF开始下降, 5 min 时APA、Vmax也开始减小, RPF继续下降; 当灌流10 min时, APA、Vmax、VDD和RPF与正常相比P＜0.01。MDP和APD无明显改变。

2.2 TTX对主动脉前庭慢电位的影响

用1.2 mmol/L 河豚毒灌流1 min时, APA、Vmax、VDD和RFP开始降低, 5 min时由灌流前的54.9±2.9 mV、11.3±1.1 v/s、32.1±2.4 mV/s 和178±8 bmp分别变为50.9±1.7 mV、 9.2±0.6 v/s、24±1.3 mV/s和 108±7 bmp, aPA和Vmax与对照相比P＜0.05,VDD和RFP与对照相比P＜0.01, 10 min 时稳定于此水平。

2.3 4-AP对主动脉前庭慢反应电位的影响

用2 mmol/L 4-AP灌流5 min时, MDP、APA、Vmax减小, 由灌流前的-54.8±3.2 mV、54.2±2.9 mV和10.2±2.3 v/s 分别变为-33.7±2.5 mV、30.6±2.9 mV和6.1±1.4 v/s, VDD和RPF 明显加快, 由灌流前的31±2.4 mV/s和160±11 bmp分别变为37.5±3.3 mV/s和189±9 bmp, 与正常对照相比有显著差异(P＜0.01); APD90延长,由正常时的159.8±7.3 ms变为178±8.9 ms,与正常对照相比有显著差异(P＜0.05), 灌流10 min 时各指标稳定于此水平。

2.4 CsCl对主动脉前庭慢反应电位的影响

用1.5 mmol/L CsCl灌流5 min时, VDD和RPF图1.不同因素对豚鼠主动脉前庭自发慢电位的影响与灌流前相比明显减慢(P＜0.05),由灌流前的32.5±2.2 mV/s和168±7 bmp变为27.1±1.2 mV/s 和145±9 bmp,其余指标无明显改变; 灌流10 min 时VDD和RPF又恢复正常。

2.5 低O2时主动脉前庭自发慢反应电位的变化

用无糖低氧液灌流5 min 时, MDP、APA、Vmax和VDD显著降低(P＜0.05), RPF似有增加, 但与正常对照比无显著差异。 灌流10 min时MDP、APA、Vmax和VDD仍低于正常对照,由正常时的-53.7±1.5 mV、52±1.9 mV、10.9±0.7 v/s和32.7±1.7 mV/s分别变为-42.9±1.9 mV、42.4±2.4 mV、8.2±0.9 v/s和24.3±0.8 mV/s, RPF开始降低, 且有节律不齐表现。灌流15 min时, MDP、APA和Vmax与正常对照无明显差异, vDD明显减慢, RPF进一步降低, APD50和APD90明显缩短。 恢复有氧灌流后,自发节律稳定。

2.6 Gli对低O2时主动脉前庭自发慢反应电位的影响

先用10 μmol/L Gli预处理标本10 min 后, 各项观测指标与正常相比均无明显变化。 然后用含Gli的低氧无糖Locke液灌流, 灌流15 min时, VDD、RPF 均明显降低。 与单纯低氧灌流15 min时各数值相比, APD90和RPF有显著差异(P＜0.05), RPF的降低程度减轻, aPD90缩短不明显。

3讨论

我们以前的工作对豚鼠左心室流出道部位的电现象和形态学进行了研究。 近几年, 对于该部位的研究有较快进展。在我们的实验结果中, 应用尼索地平和河豚毒后,主动脉前庭慢反应动作电位的APA明显减小, Vmax明显减慢, VDD和RPF也明显减慢。 说明0相和4相除极过程都有Ca2+ 和Na+内流, 而尼索地平使APA和Vmax减小程度远远大于河豚毒的作用。因此我们认为,0相主要去极离子流为Ca2+内流, 还可能有少量Na+参与; VDD和RPF明显减慢,说明Ca2+和Na+内流是4相自动除极的主要离子流之一。4-氨基吡啶作为一种非选择性钾离子通道阻断剂已广泛应用于实验研究, 其主要作用是阻断外向性钾离子流,从而影响细胞跨膜电位。众所周知, 慢反应自律细胞自律性的高低, 主要取决于最大复极电位(MDP)、阈电位(TP)和4相自动除极化速度(VDD)。由于最大复极电位的水平与膜对K+的通透性有关,当K+通透性增大时最大复极电位绝对值增大。4相除极速度取决于净内向电流的增长速度, 这种净内向电流的增长又取决于Ca2+的内流量和K+的外流量的相对比值,如果某种因素促进Ca2+内流和抑制K+外流, 4相自动除极时净内向电流增长的速度将加快, 因而使4相除极速度加快。由于心肌细胞的活动与多种钾离子通道有关[7],本实验应用钾离子通道阻断剂阻断后, VDD加快可能是由于K+外向电流减弱使IK衰减加速造成4相净内向电流增长加速, 从而使自动放电频率(RPF)增加,说明K+外流的衰减也构成了4期的自动去极化离子流。至于If电流是否参与慢反应自律细胞的4相起搏, 尚有许多争议[8、9]。 但目前有人认为,在内向背景电流基础上, 4相起搏电流中, If占的比例较小[10]。 本实验结果发现, 应用CsCl灌流5 min时, VDD和RPF明显减慢,但减慢程度不及其它因素, 10 min时恢复, 也说明If在4相起搏电流中的作用较小。低O2时, 主动脉前庭慢反应自律细胞的自发放电频率减慢, 复极时程缩短,这可能与心肌细胞膜ATP敏感性K+通道被激活有关。生理条件下, KATP一般不具有活性, 而在低O2时, 细胞内ATP降低, 通过GDP结合蛋白(Gi)与腺苷受体的耦联而被激活[11]。低氧灌流过程中,有阵发性节律失常表现, 可能由于KATP通道的开放, K+外流增多, 造成细胞外K+堆积而诱发[12]。本文应用10 μmol/L Gli预处理标本后,使低O2所致的RPF的下降程度减轻, APD缩短不明显。

综上所述, 豚鼠主动脉前庭自发慢电位的0相去极离子流主要是Ca2+内流, 也可能有少量Na+内流参与, 4相去极离子流中, 除Ca2+、Na+的内流和IK衰减外, if电流也起部分作用。

参考